Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS dəstəyi məhduddur. Ən yaxşı nəticələr üçün daha yeni bir brauzerdən istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini deaktiv etməyi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
Modik dəyişiklik (MO) heyvan modellərinin yaradılması MC-nin öyrənilməsi üçün vacib əsasdır. Əlli dörd Yeni Zelandiya Ağ dovşanı saxta əməliyyat qrupu, əzələ implantasiyası qrupu (ME qrupu) və nüvə pulposus implantasiyası qrupuna (NPE qrupu) bölündü. NPE qrupunda fəqərəarası disk anterolateral bel cərrahi yanaşması ilə açıqlandı və son lövhənin yaxınlığında L5 fəqərə gövdəsini deşmək üçün iynə istifadə edildi. NP şprislə L1/2 fəqərəarası diskdən çıxarıldı və ona yeridildi. Subkondral sümüydə deşik açıldı. Əzələ implantasiyası qrupunda və saxta əməliyyat qrupunda cərrahi prosedurlar və qazma üsulları NP implantasiyası qrupundakılarla eyni idi. ME qrupunda dəliyə bir əzələ parçası yerləşdirildi, saxta əməliyyat qrupunda isə dəliyə heç nə qoyulmadı. Əməliyyatdan sonra MRT skaneri və molekulyar bioloji testlər aparıldı. NPE qrupundakı siqnal dəyişdi, lakin saxta əməliyyat qrupunda və ME qrupunda aşkar siqnal dəyişikliyi olmadı. Histoloji müşahidələr göstərdi ki, implantasiya yerində anormal toxuma proliferasiyası müşahidə olunub və NPE qrupunda IL-4, IL-17 və IFN-γ ifadəsi artıb. NP-nin subkondral sümüyə implantasiyası MC-nin heyvan modelini yarada bilər.
Modik dəyişikliklər (MQ), maqnit rezonans görüntüləməsində (MRİ) görünən fəqərə uc lövhələrinin və bitişik sümük iliyinin zədələnmələridir. Bunlar əlaqəli simptomları olan şəxslərdə olduqca yaygındır1. Bir çox tədqiqat, bel ağrısı (BBP) ilə əlaqəli olduğuna görə MQ-nin əhəmiyyətini vurğulamışdır2,3. de Roos və digərləri4 və Modik və digərləri5 əvvəlcə fəqərə sümük iliyində üç fərqli subkondral siqnal anomaliyasını müstəqil şəkildə təsvir etmişdir. Modik I tip dəyişikliklər T1 ağırlıqlı (T1W) ardıcıllıqlarda hipointens və T2 ağırlıqlı (T2W) ardıcıllıqlarda hiperintensdir. Bu zədələnmə sümük iliyində çat uc lövhələrini və bitişik damar qranulyasiya toxumasını aşkar edir. Modik II tip dəyişikliklər həm T1W, həm də T2W ardıcıllıqlarında yüksək siqnal göstərir. Bu tip zədələnmədə uc lövhəsinin məhv edilməsi, eləcə də bitişik sümük iliyinin histoloji yağ əvəzlənməsi aşkar edilə bilər. Modik III tip dəyişikliklər T1W və T2W ardıcıllıqlarında aşağı siqnal göstərir. Uc lövhələrinə uyğun sklerotik lezyonlar müşahidə edilmişdir6. MC onurğanın patoloji xəstəliyi hesab olunur və onurğanın bir çox degenerativ xəstəlikləri ilə sıx əlaqəlidir7,8,9.
Mövcud məlumatları nəzərə alaraq, bir neçə tədqiqat MC-nin etiologiyası və patoloji mexanizmləri haqqında ətraflı məlumat vermişdir. Albert və digərləri MC-nin disk yırtığı səbəbindən yarana biləcəyini irəli sürmüşlər8. Hu və digərləri MC-ni ağır disk degenerasiyasına aid etmişlər10. Kroc təkrarlanan disk travmasının son lövhədə mikrogöz yaşlarına səbəb ola biləcəyini bildirən "daxili disk yırtığı" anlayışını irəli sürmüşdür. Yarıq əmələ gəldikdən sonra, pulposus nüvəsi (NP) tərəfindən son lövhənin məhv edilməsi otoimmun reaksiyaya səbəb ola bilər ki, bu da MC11-in inkişafına gətirib çıxarır. Ma və digərləri oxşar bir fikirdə idilər və NP-nin yaratdığı otoimmunitetin MC12-nin patogenezində əsas rol oynadığını bildirmişdilər.
İmmunitet sistemi hüceyrələri, xüsusən də CD4+ T köməkçi limfositlər, autoimmunitetin patogenezində mühüm rol oynayır13. Bu yaxınlarda kəşf edilmiş Th17 alt dəsti iltihab əleyhinə sitokin IL-17 istehsal edir, kemokin ifadəsini təşviq edir və zədələnmiş orqanlarda T hüceyrələrini IFN-γ14 istehsal etmək üçün stimullaşdırır. Th2 hüceyrələri də immun reaksiyalarının patogenezində unikal rol oynayır. IL-4-ün nümayəndəsi Th2 hüceyrəsi kimi ifadəsi ciddi immunopatoloji nəticələrə səbəb ola bilər15.
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 üzərində bir çox klinik tədqiqatlar aparılsa da, insanlarda tez-tez baş verən MC prosesini təqlid edə bilən və etiologiyasını və ya hədəf terapiya kimi yeni müalicələri araşdırmaq üçün istifadə edilə bilən uyğun heyvan təcrübə modelləri hələ də yoxdur. Bu günə qədər MC-nin yalnız bir neçə heyvan modelinin əsas patoloji mexanizmləri öyrəndiyi bildirilib.
Albert və Ma tərəfindən təklif edilən otoimmun nəzəriyyəyə əsaslanaraq, bu tədqiqat, qazılmış onurğa uc lövhəsinin yaxınlığında NP-nin avtomatik transplantasiyası ilə sadə və təkrarlana bilən dovşan MC modelini yaratdı. Digər məqsədlər heyvan modellərinin histoloji xüsusiyyətlərini müşahidə etmək və MC-nin inkişafında NP-nin spesifik mexanizmlərini qiymətləndirməkdir. Bu məqsədlə, MC-nin irəliləməsini öyrənmək üçün molekulyar biologiya, MRT və histoloji tədqiqatlar kimi üsullardan istifadə edirik.
Əməliyyat zamanı iki dovşan qanaxmadan, dörd dovşan isə MRT zamanı anesteziya zamanı ölüb. Qalan 48 dovşan sağ qalıb və əməliyyatdan sonra heç bir davranış və ya nevroloji əlamət göstərməyib.
MRT göstərir ki, müxtəlif dəliklərdəki daxilə yerləşdirilmiş toxumanın siqnal intensivliyi fərqlidir. NPE qrupundakı L5 fəqərə cisminin siqnal intensivliyi daxil edildikdən 12, 16 və 20 həftə sonra tədricən dəyişib (T1W ardıcıllığı aşağı siqnal, T2W ardıcıllığı isə qarışıq siqnal və aşağı siqnal göstərib) (Şəkil 1C), digər iki qrup daxilə yerləşdirilmiş hissələrin MRT görünüşləri isə eyni dövrdə nisbətən sabit qalıb (Şəkil 1A, B).
(A) Dovşan bel belinin 3 zaman nöqtəsindəki ardıcıl MRT-ləri. Saxta əməliyyat qrupunun görüntülərində heç bir siqnal anomaliyası aşkar edilməmişdir. (B) ME qrupundakı onurğa cisminin siqnal xüsusiyyətləri saxta əməliyyat qrupundakılara bənzəyir və zamanla yerləşdirmə yerində heç bir əhəmiyyətli siqnal dəyişikliyi müşahidə edilmir. (C) NPE qrupunda aşağı siqnal T1W ardıcıllığında, qarışıq siqnal və aşağı siqnal isə T2W ardıcıllığında aydın görünür. 12 həftəlik dövrdən 20 həftəlik dövrə qədər T2W ardıcıllığında aşağı siqnalları əhatə edən sporadik yüksək siqnallar azalır.
NPE qrupunda fəqərə cismin implantasiya yerində aşkar sümük hiperplaziyası müşahidə edilə bilər və sümük hiperplaziyası NPE qrupu ilə müqayisədə 12 həftədən 20 həftəyə qədər daha sürətli baş verir (Şəkil 2C), modelləşdirilmiş fəqərə cisimlərində əhəmiyyətli bir dəyişiklik müşahidə edilmir; Şam qrupu və ME qrupu (Şəkil 2C) 2A, B).
(A) İmplantasiya olunmuş hissədəki fəqərə gövdəsinin səthi çox hamardır, dəlik yaxşı sağalır və fəqərə gövdəsində hiperplaziya yoxdur. (B) ME qrupunda implantasiya olunmuş sahənin forması saxta əməliyyat qrupundakına bənzəyir və zamanla implantasiya olunmuş sahənin görünüşündə heç bir açıq dəyişiklik yoxdur. (C) NPE qrupunda implantasiya olunmuş sahədə sümük hiperplaziyası baş vermişdir. Sümük hiperplaziyası sürətlə artmış və hətta fəqərələrarası diskdən kontralateral fəqərə gövdəsinə qədər uzanmışdır.
Histoloji analiz sümük əmələ gəlməsi haqqında daha ətraflı məlumat verir. Şəkil 3-də H&E ilə boyanmış əməliyyatdan sonrakı hissələrin fotoşəkilləri göstərilir. Saxta əməliyyat qrupunda xondrositlər yaxşı düzülmüşdü və hüceyrə proliferasiyası aşkar edilmədi (Şəkil 3A). ME qrupundakı vəziyyət saxta əməliyyat qrupundakı vəziyyətə bənzəyirdi (Şəkil 3B). Lakin, NPE qrupunda implantasiya yerində çoxlu sayda xondrosit və NP-yə bənzər hüceyrələrin proliferasiyası müşahidə edildi (Şəkil 3C);
(A) Trabekulalar son lövhənin yaxınlığında görünür, xondrositlər səliqəli şəkildə düzülüb, hüceyrə ölçüsü və forması eynidir və proliferasiyası yoxdur (40 dəfə). (B) ME qrupunda implantasiya yerinin vəziyyəti saxta qrupun vəziyyəti ilə oxşardır. Trabekulalar və xondrositlər görünə bilər, lakin implantasiya yerində aşkar proliferasiya yoxdur (40 dəfə). (B) Xondrositlərin və NP-yə bənzər hüceyrələrin əhəmiyyətli dərəcədə çoxaldığı və xondrositlərin forması və ölçüsünün qeyri-bərabər olduğu (40 dəfə) görünür.
Həm NPE, həm də ME qruplarında interleykin 4 (IL-4) mRNT, interleykin 17 (IL-17) mRNT və interferon γ (IFN-γ) mRNT-nin ifadəsi müşahidə edilmişdir. Hədəf genlərin ifadə səviyyələri müqayisə edildikdə, IL-4, IL-17 və IFN-γ gen ifadələri NPE qrupunda ME qrupu və saxta əməliyyat qrupuna nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 4) (P < 0.05). Saxta əməliyyat qrupu ilə müqayisədə ME qrupunda IL-4, IL-17 və IFN-γ ifadə səviyyələri yalnız bir qədər artmış və statistik dəyişikliyə çatmamışdır (P > 0.05).
NPE qrupunda IL-4, IL-17 və IFN-γ-nin mRNA ifadəsi, saxta əməliyyat qrupundakı və ME qrupundakından xeyli yüksək bir tendensiya göstərdi (P < 0.05).
Bunun əksinə olaraq, ME qrupundakı ifadə səviyyələrində əhəmiyyətli bir fərq müşahidə edilməmişdir (P>0.05).
Dəyişmiş mRNA ifadə modelinin təsdiqlənməsi üçün IL-4 və IL-17-yə qarşı ticari olaraq mövcud olan antikorlardan istifadə edərək Western blot analizi aparıldı. Şəkil 5A, B-də göstərildiyi kimi, ME qrupu və saxta əməliyyat qrupu ilə müqayisədə NPE qrupunda IL-4 və IL-17 protein səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (P < 0,05). Saxta əməliyyat qrupu ilə müqayisədə ME qrupunda IL-4 və IL-17 protein səviyyələri də statistik cəhətdən əhəmiyyətli dəyişikliklərə çata bilməmişdir (P> 0,05).
(A) NPE qrupunda IL-4 və IL-17 protein səviyyələri ME qrupundakı və plasebo qrupundakı səviyyələrdən xeyli yüksək idi (P < 0.05). (B) Vestern blot histoqramı.
Əməliyyat zamanı əldə edilən insan nümunələrinin sayı məhdud olduğundan, MC-nin patogenezi ilə bağlı aydın və ətraflı tədqiqatlar bir qədər çətindir. Potensial patoloji mexanizmlərini öyrənmək üçün MC-nin heyvan modelini yaratmağa çalışdıq. Eyni zamanda, NP avtoqrefti tərəfindən induksiya edilən MC-nin gedişatını izləmək üçün radioloji qiymətləndirmə, histoloji qiymətləndirmə və molekulyar bioloji qiymətləndirmədən istifadə edildi. Nəticədə, NP implantasiya modeli toxuma dəyişikliklərini göstərən siqnal intensivliyində 12 həftəlik vaxt nöqtələrindən 20 həftəlik vaxt nöqtələrinə tədricən dəyişikliklə nəticələndi və histoloji və molekulyar bioloji qiymətləndirmələr radioloji tədqiqatın nəticələrini təsdiqlədi.
Bu təcrübənin nəticələri göstərir ki, NPE qrupunda onurğa cisminin pozulması yerində vizual və histoloji dəyişikliklər baş verib. Eyni zamanda, IL-4, IL-17 və IFN-γ genlərinin, eləcə də IL-4, IL-17 və IFN-γ-nin ifadəsi müşahidə edilib ki, bu da onurğa cismində autolojik pulposus nüvə toxumasının pozulmasının bir sıra siqnal və morfoloji dəyişikliklərə səbəb ola biləcəyini göstərir. Heyvan modelinin onurğa cismlərinin siqnal xüsusiyyətlərinin (T1W ardıcıllığında aşağı siqnal, T2W ardıcıllığında qarışıq siqnal və aşağı siqnal) insan onurğa hüceyrələrinin siqnal xüsusiyyətlərinə çox oxşar olduğunu və MRT xüsusiyyətlərinin də histologiya və ümumi anatomiyanın müşahidələrini təsdiqlədiyini, yəni onurğa cisminin hüceyrələrindəki dəyişikliklərin mütərəqqi olduğunu aşkar etmək asandır. Kəskin travmanın yaratdığı iltihabi reaksiya ponksiyondan qısa müddət sonra görünsə də, MRT nəticələri göstərib ki, tədricən artan siqnal dəyişiklikləri ponksiyondan 12 həftə sonra ortaya çıxıb və MRT dəyişikliklərinin bərpası və ya geri dönüşü əlamətləri olmadan 20 həftəyə qədər davam edib. Bu nəticələr göstərir ki, autoloji vertebral NP dovşanlarda mütərəqqi MV-nin müəyyən edilməsi üçün etibarlı bir üsuldur.
Bu ponksiyon modeli kifayət qədər bacarıq, vaxt və cərrahi səy tələb edir. İlkin təcrübələrdə paravertebral bağ strukturlarının disseksiyası və ya həddindən artıq stimullaşdırılması onurğa osteofitlərinin əmələ gəlməsinə səbəb ola bilər. Bitişik disklərə zərər verməməyə və ya qıcıqlandırmamağa diqqət yetirilməlidir. Ardıcıl və təkrarlana bilən nəticələr əldə etmək üçün nüfuzetmə dərinliyinə nəzarət edilməli olduğundan, 3 mm uzunluğunda iynənin qabığını kəsərək əl ilə tıxac düzəltdik. Bu tıxacdan istifadə onurğa gövdəsində vahid qazma dərinliyini təmin edir. İlkin təcrübələrdə əməliyyatda iştirak edən üç ortopedik cərrah 16 ölçülü iynələrin 18 ölçülü iynələrə və ya digər üsullara nisbətən daha asan işləndiyini aşkar etdilər. Qazma zamanı həddindən artıq qanaxmanın qarşısını almaq üçün iynəni bir müddət hərəkətsiz saxlamaq daha uyğun bir yerləşmə dəliyi təmin edəcək və bu da müəyyən dərəcədə MC-nin bu şəkildə idarə oluna biləcəyini göstərir.
Bir çox tədqiqat MC-ni hədəf alsa da, MC25,26,27-nin etiologiyası və patogenezi haqqında az məlumat var. Əvvəlki tədqiqatlarımıza əsasən, autoimmunitetin MC12-nin yaranmasında və inkişafında əsas rol oynadığını müəyyən etdik. Bu tədqiqat antigen stimullaşdırılmasından sonra CD4+ hüceyrələrinin əsas differensiasiya yolları olan IL-4, IL-17 və IFN-γ-nin kəmiyyət ifadəsini araşdırdı. Tədqiqatımızda, mənfi qrupla müqayisədə, NPE qrupunda IL-4, IL-17 və IFN-γ daha yüksək ifadəyə malik idi və IL-4 və IL-17-nin protein səviyyələri də daha yüksək idi.
Klinik olaraq, disk yırtığı olan xəstələrin NP hüceyrələrində IL-17 mRNT ifadəsi artır28. Sağlam nəzarət qrupu ilə müqayisədə kəskin qeyri-kompressiv disk yırtığı modelində IL-4 və IFN-γ ifadə səviyyələrinin artması da aşkar edilmişdir29. IL-17, otoimmun xəstəliklərdə iltihabda, toxuma zədələnməsində əsas rol oynayır30 və IFN-γ-yə qarşı immun reaksiyasını artırır30. MRL/lpr siçanlarında32 və otoimmunitetə həssas siçanlarda33 IL-17 vasitəçiliyi ilə toxuma zədələnməsinin artması bildirilmişdir. IL-4, proiltihab sitokinlərinin (məsələn, IL-1β və TNFα) ifadəsini və makrofaq aktivləşməsini inhibə edə bilər34. IL-4-ün mRNT ifadəsinin NPE qrupunda eyni vaxt nöqtəsində IL-17 və IFN-γ ilə müqayisədə fərqli olduğu bildirilmişdir; NPE qrupunda IFN-γ-nin mRNT ifadəsi digər qruplara nisbətən xeyli yüksək idi. Buna görə də, IFN-γ istehsalı NP interkalasiyası ilə induksiya edilən iltihab reaksiyasının vasitəçisi ola bilər. Tədqiqatlar göstərir ki, IFN-γ aktivləşdirilmiş 1-ci tip köməkçi T hüceyrələri, təbii qatil hüceyrələri və makrofaqlar35,36 daxil olmaqla birdən çox hüceyrə növü tərəfindən istehsal olunur və immun reaksiyalarını təşviq edən əsas iltihab əleyhinə sitokindir37.
Bu tədqiqat göstərir ki, MC-nin yaranmasında və inkişafında otoimmun reaksiya iştirak edə bilər. Luoma və digərləri MC və görkəmli NP-nin siqnal xüsusiyyətlərinin MRT-də oxşar olduğunu və hər ikisinin T2W ardıcıllığında yüksək siqnal göstərdiyini aşkar etdilər38. Bəzi sitokinlərin, məsələn, IL-139-un MC-nin yaranması ilə sıx əlaqəli olduğu təsdiqlənib. Ma və digərləri NP-nin yuxarı və ya aşağı çıxıntısının MC12-nin yaranmasında və inkişafında böyük təsir göstərə biləcəyini irəli sürdülər. Bobechko40 və Herzbein və digərləri41 NP-nin doğuşdan damar dövranına daxil ola bilməyən immunotolerant bir toxuma olduğunu bildirdilər. NP çıxıntıları qan tədarükünə yad cisimlər daxil edir və bununla da yerli otoimmun reaksiyalara vasitəçilik edir42. Autoimmun reaksiyalar çox sayda immun faktoruna səbəb ola bilər və bu amillər toxumalara davamlı olaraq məruz qaldıqda siqnalda dəyişikliklərə səbəb ola bilər43. Bu tədqiqatda IL-4, IL-17 və IFN-γ-nin həddindən artıq ifadəsi tipik immun amilləridir və bu da NP və MC-lər arasındakı sıx əlaqəni daha da sübut edir44. Bu heyvan modeli NP-nin sıçrayışını və son lövhəyə daxil olmasını yaxşı təqlid edir. Bu proses autoimmunitetin MC-yə təsirini daha da aşkar etdi.
Gözlənildiyi kimi, bu heyvan modeli bizə MC-ni öyrənmək üçün mümkün bir platforma təqdim edir. Lakin, bu modelin hələ də bəzi məhdudiyyətləri var: birincisi, heyvan müşahidəsi mərhələsində bəzi orta mərhələli dovşanların histoloji və molekulyar biologiya testləri üçün evtanaziya edilməsi lazımdır, buna görə də bəzi heyvanlar zamanla "istifadədən çıxır". İkincisi, bu tədqiqatda üç zaman nöqtəsi müəyyən edilsə də, təəssüf ki, biz yalnız bir MC növünü (Modik tip I dəyişikliyi) modelləşdirdik, buna görə də bu, insan xəstəliyinin inkişaf prosesini təmsil etmək üçün kifayət deyil və bütün siqnal dəyişikliklərini daha yaxşı müşahidə etmək üçün daha çox zaman nöqtəsi təyin edilməlidir. Üçüncüsü, toxuma strukturundakı dəyişikliklər həqiqətən də histoloji boyanma ilə aydın şəkildə göstərilə bilər, lakin bəzi ixtisaslaşmış üsullar bu modeldəki mikrostruktur dəyişikliklərini daha yaxşı aşkar edə bilər. Məsələn, dovşan fəqərəarası disklərində fibroqığırdaqın əmələ gəlməsini təhlil etmək üçün polyarlaşdırılmış işıq mikroskopiyasından istifadə edilmişdir45. NP-nin MC və son lövhəyə uzunmüddətli təsirləri əlavə tədqiqat tələb edir.
Əlli dörd erkək Yeni Zelandiya ağ dovşanı (çəkisi təxminən 2,5-3 kq, yaşı 3-3,5 ay) təsadüfi olaraq saxta əməliyyat qrupuna, əzələ implantasiyası qrupuna (ME qrupu) və sinir kökü implantasiyası qrupuna (NPE qrupu) bölündü. Bütün eksperimental prosedurlar Tianjin Xəstəxanasının Etika Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmiş və eksperimental metodlar təsdiq edilmiş qaydalara ciddi şəkildə uyğun olaraq həyata keçirilmişdir.
S. Sobajima 46-nın cərrahi texnikasında bəzi irəliləyişlər edilmişdir. Hər bir dovşan lateral uzanmış vəziyyətdə yerləşdirildi və ardıcıl beş bel fəqərəarası diskin (IVD) ön səthi posterolateral retroperitoneal yanaşma istifadə edilərək açıldı. Hər bir dovşana ümumi anesteziya verildi (20% uretan, qulaq damarı vasitəsilə 5 ml/kq). Qabırğaların aşağı kənarından çanaq kənarına, ventraldan paravertebral əzələlərə 2 sm məsafədə uzununa dəri kəsiyi edildi. L1-dən L6-ya qədər sağ anterolateral onurğa, üstdəki dərialtı toxumanın, retroperitoneal toxumanın və əzələlərin kəskin və küt parçalanması ilə açıldı (Şəkil 6A). Disk səviyyəsi L5-L6 disk səviyyəsi üçün anatomik bir işarə olaraq çanaq kənarından istifadə edilərək təyin edildi. L5 fəqərəsinin uc lövhəsinin yaxınlığında 3 mm dərinliyə qədər bir deşik açmaq üçün 16 ölçülü ponksiyon iynəsindən istifadə edin (Şəkil 6B). L1-L2 fəqərəarası diskdəki autolojik pulposus nüvəsini sorma üçün 5 ml şpris istifadə edin (Şəkil 6C). Hər qrupun tələblərinə uyğun olaraq pulposus nüvəsini və ya əzələsini çıxarın. Qazma dəliyi dərinləşdirildikdən sonra, əməliyyat zamanı fəqərə gövdəsinin periosteal toxumasına zərər verməməyə diqqət yetirərək, dərin fassiyaya, səthi fassiyaya və dəriyə sorulan tikişlər qoyulur.
(A) L5–L6 diski posterolateral retroperitoneal yanaşma ilə açılır. (B) L5 uc lövhəsinin yaxınlığında bir deşik açmaq üçün 16 kalibrli iynədən istifadə edin. (C) Avtoloq MF-lər toplanır.
Qulaq venası vasitəsilə 20% uretan (5 ml/kq) məhlulu ilə ümumi anesteziya tətbiq edildi və bel onurğasının rentgenoqrafiyası əməliyyatdan sonrakı 12, 16 və 20 həftədə təkrarlandı.
Dovşanlar əməliyyatdan 12, 16 və 20 həftə sonra əzələdaxili ketamin (25.0 mq/kq) və venadaxili natrium pentobarbital (1.2 q/kq) inyeksiyası ilə kəsildi. Bütün onurğa histoloji analiz üçün çıxarıldı və real analiz aparıldı. İmmun faktorlardakı dəyişiklikləri aşkar etmək üçün kəmiyyət tərs transkripsiyası (RT-qPCR) və Vestern blottinqdən istifadə edildi.
MRT müayinələri ortoqonal ətraf spiral qəbuledicisi ilə təchiz olunmuş 3.0 T klinik maqnit (GE Medical Systems, Florence, SC) istifadə edərək dovşanlarda aparılmışdır. Dovşanlar qulaq venası vasitəsilə 20% uretan (5 ml/kq) ilə anesteziya edilmiş və sonra bel bölgəsi 5 düym diametrli dairəvi səth spiralının (GE Medical Systems) mərkəzində olmaqla maqnitin içərisinə arxası üstə qoyulmuşdur. L3-L4-dən L5-L6-ya qədər bel diskinin yerini təyin etmək üçün koronal T2 ağırlıqlı lokalizator görüntüləri (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) əldə edilmişdir. Sagittal müstəvi T2 ağırlıqlı dilimlər aşağıdakı parametrlərlə əldə edilmişdir: təkrarlama müddəti (TR) 2200 ms və əks-səda müddəti (TE) 70 ms olan sürətli fırlanma-əks-səda ardıcıllığı, matris; görmə sahəsi 260 və səkkiz stimul; kəsmə qalınlığı 2 mm, boşluq 0,2 mm idi.
Sonuncu fotoşəkil çəkildikdən və sonuncu dovşan öldürüldükdən sonra, histoloji müayinə üçün saxta, əzələyə yerləşdirilmiş və NP diskləri çıxarıldı. Toxumalar 1 həftə ərzində 10% neytral buferləşdirilmiş formalində fiksasiya edildi, etilendiamintetrasirkə turşusu ilə kalsiumsuzlaşdırıldı və parafin kəsikləri ayrıldı. Toxuma blokları parafinə yerləşdirilmiş və mikrotom istifadə edərək sagittal kəsiklərə (5 μm qalınlığında) kəsilmişdir. Kəsiklər hematoksilin və eozin (H&E) ilə boyanmışdır.
Hər qrupdakı dovşanlardan fəqərəarası disklər toplandıqdan sonra, istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq UNIQ-10 sütunu (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Çin) və ImProm II tərs transkripsiya sistemi (Promega Inc., Madison, WI, ABŞ) istifadə edilərək ümumi RNT çıxarıldı. Tərs transkripsiya aparıldı.
RT-qPCR, istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ABŞ) və SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) istifadə edilərək həyata keçirildi. PCR reaksiyasının həcmi 20 μl idi və 1,5 μl seyreltilmiş kDNT və hər bir praymerdən 0,2 μM ibarət idi. Praymerlər OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) tərəfindən dizayn edilmiş və Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Çin) tərəfindən istehsal edilmişdir (Cədvəl 1). Aşağıdakı istilik dövrü şərtlərindən istifadə edilmişdir: ilkin polimeraza aktivləşdirmə mərhələsi 94°C-də 2 dəqiqə, sonra şablon denaturasiyası üçün 94°C-də hər biri 15 saniyədən ibarət 40 dövr, 60°C-də 1 dəqiqə tavlama, genişləndirmə və flüoresans. Ölçmələr 72°C-də 1 dəqiqə ərzində aparılmışdır. Bütün nümunələr üç dəfə gücləndirilmiş və orta dəyər RT-qPCR analizi üçün istifadə edilmişdir. Gücləndirmə məlumatları FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ABŞ) istifadə edilərək təhlil edilmişdir. IL-4, IL-17 və IFN-γ gen ifadəsi endogen nəzarətə (ACTB) normallaşdırılmışdır. Hədəf mRNT-nin nisbi ifadə səviyyələri 2-ΔΔCT metodu ilə hesablanmışdır.
Ümumi protein, RIPA lizis buferində (proteaza və fosfataza inhibitor kokteyli ehtiva edən) toxuma homogenizatoru istifadə edərək toxumalardan çıxarıldı və sonra toxuma qalıqlarını təmizləmək üçün 4°C-də 20 dəqiqə ərzində 13000 dövr/dəq sürətlə santrifüj edildi. Hər zolağa əlli mikroqram protein yükləndi, 10% SDS-PAGE ilə ayrıldı və sonra PVDF membranına köçürüldü. Bloklama, otaq temperaturunda 1 saat ərzində 0,1% Tween 20 tərkibli Tris-buferli salin məhlulunda (TBS) 5% yağsız quru süddə aparıldı. Membran, dovşan anti-dekorin ilkin antikoru (1:200 nisbətində durulaşdırılmış; Boster, Uhan, Çin) (1:200 nisbətində durulaşdırılmış; Bioss, Pekin, Çin) ilə gecə 4°C-də inkubasiya edildi və ikinci günlərdə reaksiya verildi; otaq temperaturunda 1 saat ərzində xren peroksidazı (Boster, Uhan, Çin) ilə birlikdə ikincili antikor (keçi anti-dovşan immunoglobulini G 1:40,000 durulaşdırmada) ilə birlikdə istifadə edilmişdir. Qərb ləkə siqnalları rentgen şüalanmasından sonra xemilüminesensiya membranında artan xemilüminesensiya ilə aşkar edilmişdir. Densitometrik analiz üçün ləkələr skan edilmiş və BandScan proqram təminatı istifadə edilərək kəmiyyətləşdirilmiş və nəticələr hədəf gen immunoreaktivliyinin tubulin immunoreaktivliyinə nisbəti kimi ifadə edilmişdir.
Statistik hesablamalar SPSS16.0 proqram paketi (SPSS, ABŞ) istifadə edilərək aparılmışdır. Tədqiqat zamanı toplanan məlumatlar orta ± standart sapma (orta ± SD) kimi ifadə edilmiş və iki qrup arasındakı fərqləri müəyyən etmək üçün birtərəfli təkrarlanan ölçmə dispersiyası təhlili (ANOVA) istifadə edilərək təhlil edilmişdir. P < 0.05 statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir.
Beləliklə, onurğa bədəninə autoloji NP-lərin implantasiyası və makroanatomik müşahidə, MRT analizi, histoloji qiymətləndirmə və molekulyar bioloji analiz aparmaqla MC-nin heyvan modelinin yaradılması insan MC-nin mexanizmlərini qiymətləndirmək və anlamaq, eləcə də yeni terapevtik müdaxilələr hazırlamaq üçün vacib bir vasitəyə çevrilə bilər.
Bu məqaləyə necə istinad etmək olar: Han, C. və b. Modik dəyişikliklərinin heyvan modeli bel onurğasının subkondral sümüyünə autoloji pulposus nüvəsinin implantasiyası ilə yaradılmışdır. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. və Boos, N. Bel onurğasının maqnit-rezonans görüntüləməsi: asimptomatik könüllülərdə disk yırtığı və tutulmasının, sinir kökünün sıxılmasının, son lövhə anomaliyalarının və faset oynağının osteoartritinin yayılması. Radiologiya 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS və Leboeuf-Eed, K. Modic dəyişiklikləri və onların klinik tapıntılarla əlaqəsi. Avropa Onurğa Jurnalı: Avropa Onurğa Cəmiyyətinin, Avropa Onurğa Deformasiyaları Cəmiyyətinin və Avropa Servikal Onurğa Tədqiqatları Cəmiyyətinin rəsmi nəşri 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. və b. Bel fəqərələrinin son lövhələrində modifikasiya dəyişiklikləri: orta yaşlı kişi işçilərdə bel ağrısı və siyatikanın yayılması və onlarla əlaqəsi. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. və Dalinka, M. Bel onurğasının degenerativ xəstəliyində son lövhəyə yaxın sümük iliyi dəyişikliklərinin MRT müayinəsi. AJR. Amerika Radiologiya Jurnalı 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ və Carter, JR Degenerativ disk xəstəliyi: onurğa iliyi dəyişikliklərinin MRT ilə qiymətləndirilməsi. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS və Carter, JR Degenerativ disk xəstəliyinin görüntülənməsi. Radiologiya 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS və b. Ümumi populyasiyada neovertebral son lövhə (Modic) siqnal dəyişikliklərinin proqnozlaşdırıcıları. Avropa Onurğa Jurnalı: Avropa Onurğa Cəmiyyətinin, Avropa Onurğa Deformasiyaları Cəmiyyətinin və Avropa Servikal Onurğa Tədqiqatları Cəmiyyətinin rəsmi nəşri, Bölmə 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB və Mannisch, K. Bel disk yırtığından sonra Modic dəyişiklikləri. Avropa Onurğa Jurnalı: Avropa Onurğa Cəmiyyətinin, Avropa Onurğa Deformasiyaları Cəmiyyətinin və Avropa Servikal Onurğa Tədqiqatları Cəmiyyətinin rəsmi nəşri 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., və Kaapa, E. Modic I tip dəyişiklikləri sürətlə irəliləyən deformasiya disk degenerasiyasını proqnozlaşdıra bilər: 1 illik perspektivli bir tədqiqat. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ və Fan, SW Modic dəyişiklikləri: bel diskinin degenerasiyasına mümkün səbəblər və töhfə. Tibbi Hipotezlər 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Daxili disk yırtığı. 50 il ərzində disk prolapsı problemləri. Onurğa (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Yazı vaxtı: 13 Dekabr 2024