Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var. Ən yaxşı nəticələr üçün daha yeni brauzerdən istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyi) tövsiyə edirik. Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı üslub və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
Modic dəyişikliklərin heyvan modellərinin (MC) yaradılması MC-nin öyrənilməsi üçün mühüm əsasdır. Əlli dörd Yeni Zelandiya Ağ dovşanı saxta əməliyyat qrupuna, əzələ implantasiyası qrupuna (ME qrupu) və nüvə pulposus implantasiyası qrupuna (NPE qrupu) bölündü. NPE qrupunda anterolateral lomber cərrahi yanaşma ilə fəqərəarası disk ifşa edildi və son lövhənin yaxınlığında L5 vertebra gövdəsini deşmək üçün iynədən istifadə edildi. NP L1/2 fəqərəarası diskdən şprislə çıxarılıb və ona vurulub. Subkondral sümükdə bir deşik qazmaq. Əzələ implantasiyası qrupunda və saxta əməliyyat qrupunda cərrahi prosedurlar və qazma üsulları NP implantasiya qrupunda olanlarla eyni idi. ME qrupunda çuxura əzələ parçası yerləşdirildiyi halda, saxta əməliyyat qrupunda heç bir şey çuxura yerləşdirilməyib. Əməliyyatdan sonra MRT müayinəsi və molekulyar bioloji testlər aparılıb. NPE qrupunda siqnal dəyişdi, lakin saxta əməliyyat qrupu və ME qrupunda heç bir açıq siqnal dəyişikliyi olmadı. Histoloji müşahidə implantasiya yerində anormal toxuma proliferasiyasının müşahidə edildiyini, NPE qrupunda IL-4, IL-17 və IFN-γ ifadəsinin artdığını göstərdi. NP-nin subkondral sümüyə implantasiyası MC-nin heyvan modelini yarada bilər.
Modic dəyişikliklər (MC) maqnit rezonans görüntüləmədə (MRT) görünən vertebral son lövhələrin və bitişik sümük iliyinin zədələnməsidir. Onlar əlaqəli simptomları olan şəxslərdə olduqca yaygındır1. Bir çox tədqiqat bel ağrısı (LBP) 2,3 ilə əlaqəsi səbəbiylə MC-nin əhəmiyyətini vurğuladı. de Roos et al.4 və Modic et al.5 müstəqil olaraq ilk dəfə fəqərə sümük iliyində üç müxtəlif subxondral siqnal anormallığını təsvir etmişlər. Modic tip I dəyişikliklər T1-çəkili (T1W) ardıcıllıqlarda hipointens və T2-çəkili (T2W) ardıcıllıqlarda hiperintens olur. Bu lezyon sümük iliyində fissura son plitələrini və bitişik damar qranulyasiya toxumasını aşkar edir. Modic tip II dəyişikliklər həm T1W, həm də T2W ardıcıllığında yüksək siqnal göstərir. Bu tip lezyonlarda endplate destruksiyasına, həmçinin bitişik sümük iliyinin histoloji yağının dəyişdirilməsinə rast gəlmək olar. Modic tip III dəyişikliklər T1W və T2W ardıcıllığında aşağı siqnal göstərir. Son plitələrə uyğun gələn sklerotik lezyonlar müşahidə edilmişdir6. MC onurğanın patoloji xəstəliyi hesab olunur və onurğanın bir çox degenerativ xəstəlikləri ilə sıx bağlıdır7,8,9.
Mövcud məlumatları nəzərə alaraq, bir neçə tədqiqat MC-nin etiologiyası və patoloji mexanizmləri haqqında ətraflı məlumat verdi. Albert və başqaları. MC-nin disk yırtığından qaynaqlana biləcəyini irəli sürdü8. Hu və başqaları. MC-ni ağır disk degenerasiyası ilə əlaqələndirdi10. Kroc, təkrarlanan disk travmasının son lövhədə mikro yırtıqlara səbəb ola biləcəyini bildirən "daxili diskin yırtılması" konsepsiyasını təklif etdi. Yarıq əmələ gəldikdən sonra pulpoz nüvəsi (NP) tərəfindən endplate məhv edilməsi otoimmün reaksiyaya səbəb ola bilər ki, bu da daha sonra MC11-in inkişafına səbəb olur. Ma və başqaları. oxşar fikri paylaşdı və NP-nin səbəb olduğu otoimmünitetin MC12 patogenezində əsas rol oynadığını bildirdi.
İmmunitet sisteminin hüceyrələri, xüsusən CD4+ T köməkçi limfositləri otoimmünitetin patogenezində mühüm rol oynayır13. Bu yaxınlarda kəşf edilmiş Th17 alt dəsti IL-17 proinflamatuar sitokin istehsal edir, kemokin ifadəsini təşviq edir və IFN-γ14 istehsal etmək üçün zədələnmiş orqanlarda T hüceyrələrini stimullaşdırır. Th2 hüceyrələri immun cavabların patogenezində də unikal rol oynayır. IL-4-ün Th2 hüceyrəsi kimi ifadə edilməsi ağır immunopatoloji nəticələrə səbəb ola bilər15.
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 üzərində çoxlu klinik tədqiqatlar aparılsa da, insanlarda tez-tez baş verən və MC prosesini təqlid edə bilən uyğun heyvan eksperimental modelləri hələ də yoxdur. etiologiyanı və ya hədəflənmiş terapiya kimi yeni müalicələri araşdırmaq üçün istifadə olunur. Bu günə qədər MC-nin yalnız bir neçə heyvan modeli əsas patoloji mexanizmləri öyrənmək üçün bildirilmişdir.
Albert və Ma tərəfindən təklif olunan otoimmün nəzəriyyəyə əsaslanaraq, bu iş, qazılmış vertebral son lövhənin yaxınlığında NP-ni avtotransplantasiya etməklə sadə və təkrarlana bilən dovşan MC modelini qurdu. Digər məqsədlər heyvan modellərinin histoloji xüsusiyyətlərini müşahidə etmək və MC-nin inkişafında NP-nin xüsusi mexanizmlərini qiymətləndirməkdir. Bu məqsədlə, MC-nin inkişafını öyrənmək üçün molekulyar biologiya, MRT və histoloji tədqiqatlar kimi üsullardan istifadə edirik.
İki dovşan əməliyyat zamanı qanaxmadan, dörd dovşan isə MRT zamanı anesteziya zamanı ölüb. Qalan 48 dovşan sağ qaldı və əməliyyatdan sonra heç bir davranış və ya nevroloji əlamət göstərmədi.
MRT müxtəlif deşiklərdə gömülü toxumanın siqnal intensivliyinin fərqli olduğunu göstərir. NPE qrupunda L5 vertebral bədəninin siqnal intensivliyi daxil edildikdən sonra 12, 16 və 20 həftədə tədricən dəyişdi (T1W ardıcıllığı aşağı siqnal göstərdi və T2W ardıcıllığı qarışıq siqnal və aşağı siqnal göstərdi) (Şəkil 1C), MRT görünüşləri isə gömülü hissələrin digər iki qrupunun eyni dövrdə nisbətən sabit qaldı (Şəkil 1A, B).
(A) 3 vaxt nöqtəsində dovşan belinin ardıcıl MRT-ləri. Saxta əməliyyat qrupunun görüntülərində heç bir siqnal anormallığı aşkar edilməyib. (B) ME qrupunda vertebral orqanın siqnal xüsusiyyətləri saxta əməliyyat qrupunda olanlara bənzəyir və zamanla yerləşdirmə yerində əhəmiyyətli siqnal dəyişikliyi müşahidə edilmir. (C) NPE qrupunda aşağı siqnal T1W ardıcıllığında aydın görünür və qarışıq siqnal və aşağı siqnal T2W ardıcıllığında aydın görünür. 12 həftəlik dövrdən 20 həftəlik dövrə qədər, T2W ardıcıllığında aşağı siqnalları əhatə edən sporadik yüksək siqnallar azalır.
NPE qrupunda vertebral bədənin implantasiya yerində aşkar sümük hiperplaziyası görünə bilər və sümük hiperplaziyası NPE qrupu ilə müqayisədə 12-dən 20-yə qədər daha sürətli baş verir (Şəkil 2C), modelləşdirilmiş vertebralda əhəmiyyətli dəyişiklik müşahidə edilmir. orqanlar; Şam qrupu və ME qrupu (Şəkil 2C) 2A,B).
(A) İmplantasiya olunmuş hissədə fəqərə gövdəsinin səthi çox hamardır, dəlik yaxşı sağalır, fəqərə gövdəsində hiperplaziya yoxdur. (B) ME qrupunda implantasiya edilmiş sahənin forması saxta əməliyyat qrupunun formasına bənzəyir və zaman keçdikcə implantasiya edilmiş sahənin görünüşündə aşkar dəyişiklik yoxdur. (C) NPE qrupunda implantasiya edilmiş yerdə sümük hiperplaziyası baş verdi. Sümük hiperplaziyası sürətlə artdı və hətta fəqərəarası disk vasitəsilə əks vertebral gövdəyə qədər uzandı.
Histoloji analiz sümük formalaşması haqqında daha ətraflı məlumat verir. Şəkil 3-də H&E ilə boyanmış əməliyyatdan sonrakı bölmələrin fotoşəkilləri göstərilir. Sham-əməliyyat qrupunda xondrositlər yaxşı qurulmuşdu və hüceyrə proliferasiyası aşkar edilməmişdir (Şəkil 3A). ME qrupunda vəziyyət saxta əməliyyat qrupundakı vəziyyətə bənzəyirdi (Şəkil 3B). Bununla belə, NPE qrupunda implantasiya yerində çoxlu sayda xondrositlər və NP-yə bənzər hüceyrələrin yayılması müşahidə edilmişdir (Şəkil 3C);
(A) Son lövhənin yaxınlığında trabekulalar görünə bilər, xondrositlər vahid hüceyrə ölçüsü və forması ilə səliqəli şəkildə düzülür və çoxalmaz (40 dəfə). (B) ME qrupunda implantasiya yerinin vəziyyəti saxta qrupun vəziyyətinə bənzəyir. Trabekulalar və xondrositlər görünə bilər, lakin implantasiya yerində (40 dəfə) aşkar proliferasiya yoxdur. (B) Xondrositlərin və NP-yə bənzər hüceyrələrin əhəmiyyətli dərəcədə çoxaldığını, xondrositlərin forma və ölçülərinin qeyri-bərabər olduğunu görmək olar (40 dəfə).
Həm NPE, həm də ME qruplarında interleykin 4 (IL-4) mRNT, interleykin 17 (IL-17) mRNT və interferon γ (IFN-γ) mRNA-nın ifadəsi müşahidə edilmişdir. Hədəf genlərin ifadə səviyyələri müqayisə edildikdə, IL-4, IL-17 və IFN-γ gen ifadələri ME qrupu və saxta əməliyyat qrupu ilə müqayisədə NPE qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 4). (P <0,05). Saxta əməliyyat qrupu ilə müqayisədə, ME qrupunda IL-4, IL-17 və IFN-γ ifadə səviyyələri yalnız bir qədər artdı və statistik dəyişikliyə çatmadı (P> 0.05).
NPE qrupunda IL-4, IL-17 və IFN-γ-nin mRNA ifadəsi saxta əməliyyat qrupu və ME qrupundakılardan əhəmiyyətli dərəcədə yüksək tendensiya göstərdi (P <0.05).
Bunun əksinə olaraq, ME qrupunda ifadə səviyyələri əhəmiyyətli bir fərq göstərmədi (P>0.05).
Dəyişdirilmiş mRNA ifadə modelini təsdiqləmək üçün IL-4 və IL-17-yə qarşı kommersiyada mövcud olan antikorlardan istifadə etməklə Western blot analizi aparılmışdır. Şəkil 5A,B-də göstərildiyi kimi, ME qrupu və saxta əməliyyat qrupu ilə müqayisədə, NPE qrupunda IL-4 və IL-17-nin protein səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (P <0.05). Saxta əməliyyat qrupu ilə müqayisədə, ME qrupunda IL-4 və IL-17 protein səviyyələri də statistik əhəmiyyətli dəyişikliklərə çata bilmədi (P> 0.05).
(A) NPE qrupunda IL-4 və IL-17-nin zülal səviyyələri ME qrupu və plasebo qrupundan əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (P <0.05). (B) Western blot histoqramı.
Əməliyyat zamanı əldə edilən insan nümunələrinin məhdud sayda olması səbəbindən MC-nin patogenezi ilə bağlı aydın və ətraflı tədqiqatlar bir qədər çətindir. Potensial patoloji mexanizmlərini öyrənmək üçün MC-nin heyvan modelini yaratmağa cəhd etdik. Eyni zamanda, radioloji qiymətləndirmə, histoloji qiymətləndirmə və molekulyar bioloji qiymətləndirmə NP autogreft tərəfindən törədilən MC kursunu izləmək üçün istifadə edilmişdir. Nəticədə, NP implantasiya modeli siqnal intensivliyinin 12 həftədən 20 həftəlik vaxt nöqtələrinə qədər tədricən dəyişməsi ilə nəticələndi (T1W ardıcıllığında qarışıq aşağı siqnal və T2W ardıcıllığında aşağı siqnal), toxuma dəyişikliklərini və histoloji və molekulyar bioloji qiymətləndirmələr radioloji tədqiqatın nəticələrini təsdiqlədi.
Bu eksperimentin nəticələri göstərir ki, NPE qrupunda vertebral orqan pozuntusu yerində vizual və histoloji dəyişikliklər baş vermişdir. Eyni zamanda, IL-4, IL-17 və IFN-γ genlərinin, həmçinin IL-4, IL-17 və IFN-γ genlərinin ifadəsi müşahidə edilmişdir ki, bu da onurğada pulpozun otolog nüvəsinin pozulmasının olduğunu göstərir. bədən bir sıra siqnal və morfoloji dəyişikliklərə səbəb ola bilər. Heyvan modelinin onurğa cisimlərinin siqnal xüsusiyyətlərinin (T1W ardıcıllığında aşağı siqnal, qarışıq siqnal və T2W ardıcıllığında aşağı siqnal) insan onurğa hüceyrələrinə çox oxşar olduğunu tapmaq asandır və MRT xüsusiyyətləri də histologiya və ümumi anatomiyanın müşahidələrini təsdiqləyin, yəni vertebral bədən hüceyrələrində dəyişikliklər mütərəqqi xarakter daşıyır. Kəskin travmanın yaratdığı iltihab reaksiyası ponksiyondan dərhal sonra görünə bilsə də, MHİ nəticələri göstərdi ki, proqressiv artan siqnal dəyişiklikləri ponksiyondan 12 həftə sonra yaranıb və MHİ dəyişikliklərinin bərpası və ya geri qaytarılması əlamətləri olmadan 20 həftəyə qədər davam edib. Bu nəticələr autoloq vertebral NP-nin dovşanlarda mütərəqqi MV-nin yaradılması üçün etibarlı bir üsul olduğunu göstərir.
Bu ponksiyon modeli adekvat bacarıq, vaxt və cərrahi səy tələb edir. İlkin təcrübələrdə paravertebral ligamentöz strukturların parçalanması və ya həddindən artıq stimullaşdırılması vertebral osteofitlərin əmələ gəlməsi ilə nəticələnə bilər. Bitişik disklərə zərər verməmək və ya qıcıqlandırmamaq üçün diqqətli olmaq lazımdır. Ardıcıl və təkrarlana bilən nəticələr əldə etmək üçün nüfuz dərinliyinə nəzarət edilməli olduğundan, 3 mm uzunluğunda iynənin qabığını kəsərək əl ilə tıxac etdik. Bu tıxacın istifadəsi vertebral gövdədə vahid qazma dərinliyini təmin edir. İlkin təcrübələrdə əməliyyatda iştirak edən üç ortoped cərrah 16 kalibrli iynələrin 18 kalibrli iynələrlə və ya digər üsullarla işləməsindən daha asan olduğunu tapıb. Qazma zamanı həddindən artıq qanaxmanın qarşısını almaq üçün iynəni bir müddət hərəkətsiz saxlamaq daha uyğun bir daxiletmə çuxurunu təmin edəcək və bu, müəyyən dərəcədə MC-nin bu şəkildə idarə oluna biləcəyini göstərir.
Bir çox tədqiqatların MC-ni hədəf almasına baxmayaraq, MC-nin etiologiyası və patogenezi haqqında çox az şey məlumdur25,26,27. Əvvəlki araşdırmalarımıza əsaslanaraq, MC12-nin meydana gəlməsində və inkişafında autoimmunitetin əsas rol oynadığını aşkar etdik. Bu iş antigen stimullaşdırılmasından sonra CD4+ hüceyrələrinin əsas differensiasiya yolları olan IL-4, IL-17 və IFN-γ-nın kəmiyyət ifadəsini araşdırdı. Tədqiqatımızda, mənfi qrupla müqayisədə, NPE qrupunda IL-4, IL-17 və IFN-γ daha yüksək ifadə edildi və IL-4 və IL-17 protein səviyyələri də daha yüksək idi.
Klinik olaraq disk yırtığı olan xəstələrin NP hüceyrələrində IL-17 mRNT ifadəsi artır28. IL-4 və IFN-γ ifadə səviyyələrinin artması, sağlam nəzarətlərlə müqayisədə kəskin qeyri-kompresiv disk yırtığı modelində də aşkar edilmişdir29. IL-17 otoimmün xəstəliklərdə iltihabda, toxuma zədələnməsində əsas rol oynayır30 və IFN-γ31-ə qarşı immun cavabı gücləndirir. MRL/lpr siçanlarında32 və otoimmünliyə həssas siçanlarda33 gücləndirilmiş IL-17 vasitəçiliyi ilə toxuma zədələnməsi bildirilmişdir. IL-4 proinflamatuar sitokinlərin (məsələn, IL-1β və TNFα) ifadəsini və makrofaqların aktivləşdirilməsini maneə törədə bilər34. IL-4-ün mRNT ifadəsinin NPE qrupunda eyni vaxtda IL-17 və IFN-γ ilə müqayisədə fərqli olduğu bildirildi; NPE qrupunda IFN-γ-nın mRNA ifadəsi digər qruplara nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur. Buna görə də, IFN-γ istehsalı NP interkalasiyası ilə induksiya olunan iltihab reaksiyasının vasitəçisi ola bilər. Tədqiqatlar göstərdi ki, IFN-γ aktivləşdirilmiş tip 1 köməkçi T hüceyrələri, təbii öldürücü hüceyrələr və makrofaqlar daxil olmaqla bir çox hüceyrə tipləri tərəfindən istehsal olunur35,36 və immun cavabları təşviq edən əsas iltihab əleyhinə sitokindir37.
Bu araşdırma, otoimmün reaksiyanın MC-nin meydana gəlməsində və inkişafında iştirak edə biləcəyini göstərir. Luoma və başqaları. aşkar etdi ki, MC və görkəmli NP-nin siqnal xüsusiyyətləri MRT-də oxşardır və hər ikisi T2W ardıcıllığında yüksək siqnal göstərir38. Bəzi sitokinlərin IL-139 kimi MC-nin meydana gəlməsi ilə yaxından əlaqəli olduğu təsdiq edilmişdir. Ma və başqaları. NP-nin yuxarı və ya aşağı çıxmasının MC12-nin meydana gəlməsinə və inkişafına böyük təsir göstərə biləcəyini təklif etdi. Bobechko40 və Herzbein et al.41 bildirdilər ki, NP doğuşdan damar dövranına daxil ola bilməyən immunotolerant toxumadır. NP çıxıntıları yad cisimləri qan tədarükünə daxil edir və bununla da yerli otoimmün reaksiyalara vasitəçilik edir42. Otoimmün reaksiyalar çoxlu sayda immun faktorlara səbəb ola bilər və bu amillər davamlı olaraq toxumalara məruz qaldıqda siqnalın dəyişməsinə səbəb ola bilər43. Bu tədqiqatda IL-4, IL-17 və IFN-γ-nın həddindən artıq ekspressiyası tipik immun faktorlardır və NP və MCs44 arasında sıx əlaqəni daha da sübut edir. Bu heyvan modeli NP sıçrayışını və son boşqaba daxil olmasını yaxşı təqlid edir. Bu proses autoimmunitetin MC-yə təsirini daha da ortaya qoydu.
Gözlənildiyi kimi, bu heyvan modeli bizə MC-ni öyrənmək üçün mümkün platforma təqdim edir. Bununla belə, bu modelin hələ də bəzi məhdudiyyətləri var: birincisi, heyvanların müşahidəsi mərhələsində bəzi ara mərhələli dovşanların histoloji və molekulyar biologiya testləri üçün evtanizasiyası lazımdır, buna görə də bəzi heyvanlar zamanla “istifadədən çıxır”. İkincisi, bu tədqiqatda üç vaxt nöqtəsi müəyyən edilsə də, təəssüf ki, biz yalnız bir növ MC (Modic tip I dəyişiklik) modelləşdirdik, buna görə də insan xəstəliyinin inkişaf prosesini təmsil etmək kifayət deyil və daha çox vaxt nöqtəsi təyin edilməlidir. bütün siqnal dəyişikliklərini daha yaxşı müşahidə edin. Üçüncüsü, toxuma strukturunda dəyişikliklər həqiqətən histoloji boyanma ilə aydın şəkildə göstərilə bilər, lakin bəzi ixtisaslaşmış üsullar bu modeldə mikrostruktur dəyişiklikləri daha yaxşı aşkar edə bilər. Məsələn, dovşan intervertebral disklərində lifli qığırdaqların əmələ gəlməsini təhlil etmək üçün qütblü işıq mikroskopundan istifadə edilmişdir45. NP-nin MC və endplate üzərində uzunmüddətli təsiri əlavə tədqiqat tələb edir.
Əlli dörd erkək Yeni Zelandiya ağ dovşanı (çəkisi təxminən 2,5-3 kq, yaşı 3-3,5 aylıq) təsadüfi olaraq saxta əməliyyat qrupuna, əzələ implantasiyası qrupuna (ME qrupu) və sinir kökü implantasiyası qrupuna (NPE qrupu) bölündü. Bütün eksperimental prosedurlar Tianjin Xəstəxanasının Etika Komitəsi tərəfindən təsdiqləndi və eksperimental üsullar təsdiq edilmiş təlimatlara ciddi şəkildə uyğun olaraq həyata keçirildi.
S. Sobajimanın cərrahi texnikasında bəzi təkmilləşdirmələr edilmişdir 46 . Hər bir dovşan lateral uzanmış vəziyyətdə yerləşdirildi və beş ardıcıl bel intervertebral diskinin (IVD) ön səthi posterolateral retroperitoneal yanaşma ilə ifşa edildi. Hər dovşana ümumi anesteziya (qulaq damarı vasitəsilə 20% uretan, 5 ml/kq) verildi. Qabırğaların aşağı kənarından çanaq kənarına qədər, paravertebral əzələlərə qədər 2 sm ventral dərinin uzununa kəsilməsi aparıldı. L1-dən L6-ya qədər sağ anterolateral onurğa yuxarıdakı dərialtı toxuma, retroperitoneal toxuma və əzələlərin kəskin və küt parçalanması ilə ifşa edildi (Şəkil 6A). Disk səviyyəsi L5-L6 disk səviyyəsi üçün anatomik əlamət kimi çanaq kənarından istifadə edilməklə müəyyən edilmişdir. L5 fəqərəsinin son plitəsi yaxınlığında 3 mm dərinliyə qədər deşik açmaq üçün 16 kalibrli ponksiyon iynəsindən istifadə edin (Şəkil 6B). L1-L2 fəqərəarası diskdə pulpozun otolog nüvəsini aspirasiya etmək üçün 5 ml-lik şprisdən istifadə edin (Şəkil 6C). Hər bir qrupun tələblərinə uyğun olaraq pulpoz nüvəsini və ya əzələni çıxarın. Qazma dəliyi dərinləşdirildikdən sonra əməliyyat zamanı fəqərə gövdəsinin periost toxumasının zədələnməməsinə diqqət yetirərək dərin fasyaya, səthi fasiyaya və dəriyə sorulan tikişlər qoyulur.
(A) L5-L6 diski posterolateral retroperitoneal yanaşma ilə ifşa olunur. (B) 16 kalibrli iynə ilə L5 son lövhənin yaxınlığında bir deşik qazın. (C) Autologous MFs yığılır.
Qulaq damarı vasitəsilə 20% uretan (5 ml/kq) ilə ümumi anesteziya aparıldı və əməliyyatdan sonrakı 12, 16 və 20 həftələrdə bel onurğasının rentgenoqrafiyası təkrarlandı.
Dovşanlar əməliyyatdan sonra 12, 16 və 20-ci həftələrdə ketamin (25,0 mq/kq) və venadaxili natrium pentobarbital (1,2 q/kq) əzələdaxili yeridilməsi ilə qurban edilmişdir. Histoloji analiz üçün bütün onurğa çıxarıldı və real analiz aparıldı. İmmun faktorlarındakı dəyişiklikləri aşkar etmək üçün kəmiyyət tərs transkripsiya (RT-qPCR) və Western blotting istifadə edilmişdir.
MRT müayinələri dovşanlarda 3.0 T klinik maqnitdən (GE Medical Systems, Florence, SC) istifadə edərək, ortoqonal əza sarmal qəbuledicisi ilə təchiz edilmişdir. Dovşanlar qulaq damarı vasitəsilə 20% uretan (5 ml/kq) ilə anesteziya edildi və sonra bel bölgəsi 5 düym diametrli dairəvi səth sarmalında (GE Medical Systems) mərkəzləşərək maqnit daxilində uzanmış vəziyyətdə yerləşdirildi. L3-L4-dən L5-L6-ya qədər bel diskinin yerini müəyyən etmək üçün koronal T2-çəkili lokalizator şəkilləri (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) əldə edilmişdir. Sagittal müstəvi T2-çəkili dilimlər aşağıdakı parametrlərlə əldə edilmişdir: 2200 ms təkrarlama vaxtı (TR) və 70 ms əks-səda vaxtı (TE) ilə sürətli spin-echo ardıcıllığı, matris; 260 və səkkiz stimulun görmə sahəsi; Kəsmə qalınlığı 2 mm, boşluq 0,2 mm idi.
Son fotoşəkil çəkildikdən və sonuncu dovşan öldürüldükdən sonra, histoloji müayinə üçün saxta, əzələyə gömülmüş və NP diskləri çıxarıldı. Toxumalar 1 həftə ərzində 10% neytral tamponlu formalində fiksasiya edilib, etilendiamintetraasetik turşu ilə dekalsifikasiya edilib və parafinlə kəsilib. Toxuma blokları parafinə daxil edildi və mikrotomdan istifadə edərək sagittal hissələrə (5 μm qalınlığında) kəsildi. Bölmələr hematoksilin və eozin (H&E) ilə boyandı.
Hər qrupdakı dovşanlardan fəqərəarası disklər toplandıqdan sonra ümumi RNT istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq UNIQ-10 sütunundan (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Çin) və ImProm II əks transkripsiya sistemindən (Promega Inc. , Madison, WI, ABŞ). Əks transkripsiya həyata keçirildi.
RT-qPCR istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ABŞ) və SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) istifadə edilməklə həyata keçirilib. PCR reaksiyasının həcmi 20 μl idi və tərkibində 1,5 μl seyreltilmiş cDNA və hər bir primerdən 0,2 μM var idi. Astarlar OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) tərəfindən hazırlanmış və Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Çin) tərəfindən hazırlanmışdır (Cədvəl 1). Aşağıdakı istilik dövriyyəsi şərtlərindən istifadə edilmişdir: 2 dəqiqə ərzində 94°C-də ilkin polimeraz aktivləşdirmə addımı, sonra şablonun denaturasiyası üçün 94°C-də hər biri 15 saniyəlik 40 dövr, 60°C-də 1 dəqiqə müddətində yumşalma, uzadılma və flüoresan. ölçmələr 72°C-də 1 dəqiqə ərzində aparılmışdır. Bütün nümunələr üç dəfə gücləndirilmiş və orta dəyər RT-qPCR analizi üçün istifadə edilmişdir. Gücləndirmə məlumatları FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ABŞ) istifadə edərək təhlil edilmişdir. IL-4, IL-17 və IFN-γ gen ifadəsi endogen nəzarətə (ACTB) normallaşdırıldı. Hədəf mRNT-nin nisbi ifadə səviyyələri 2-ΔΔCT metodu ilə hesablanmışdır.
RIPA lizis tamponunda (tərkibində proteaza və fosfataz inhibitor kokteyli olan) toxuma homojenizatorundan istifadə edərək toxumalardan ümumi zülal çıxarıldı və sonra toxuma zibilini çıxarmaq üçün 4°C-də 20 dəqiqə 13000 rpm-də sentrifuqa edildi. Hər zolağa 50 mikroqram protein yükləndi, 10% SDS-PAGE ilə ayrıldı və sonra PVDF membranına köçürüldü. Bloklama otaq temperaturunda 1 saat ərzində 0,1% Tween 20 olan Tris tamponlu şoran məhlulunda (TBS) 5% yağsız quru süddə aparılmışdır. Membran bir gecədə 4°C temperaturda dovşan antidekorin əsas antikoru (1:200 nisbətində seyreltilmiş; Boster, Wuhan, Çin) (1:200 nisbətində seyreltilmiş; Bioss, Pekin, Çin) ilə inkubasiya edilmiş və ikinci günlərdə reaksiya verilmişdir; ikincil antikor ilə (1:40,000 seyreltmədə keçi anti-dovşan immunoqlobulini G) horseradish peroksidaza (Boster, Wuhan, Çin) ilə birlikdə otaq temperaturunda 1 saat. Western blot siqnalları rentgen şüalanmasından sonra kimilüminesans membranda artan kimilüminesans ilə aşkar edilmişdir. Densitometrik analiz üçün ləkələr skan edilmiş və BandScan proqram təminatından istifadə edərək kəmiyyəti müəyyən edilmiş və nəticələr hədəf gen immunreaktivliyinin tubulin immunreaktivliyinə nisbəti kimi ifadə edilmişdir.
Statistik hesablamalar SPSS16.0 proqram paketindən (SPSS, ABŞ) istifadə edilməklə aparılmışdır. Tədqiqat zamanı toplanmış məlumatlar orta ± standart sapma (orta ± SD) kimi ifadə edildi və iki qrup arasındakı fərqləri müəyyən etmək üçün birtərəfli təkrar ölçmə dispersiya təhlili (ANOVA) istifadə edərək təhlil edildi. P <0.05 statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir.
Beləliklə, onurğa orqanına otoloji NP-lərin implantasiyası və makroanatomik müşahidə, MRT təhlili, histoloji qiymətləndirmə və molekulyar bioloji analizin aparılması yolu ilə MC-nin heyvan modelinin yaradılması insan MC-nin mexanizmlərini qiymətləndirmək və başa düşmək və yeni terapevtik metodların hazırlanması üçün mühüm vasitə ola bilər. müdaxilələr.
Bu məqaləyə necə istinad etmək olar: Han, C. et al. Modic dəyişikliklərinin heyvan modeli, belin subxondral sümüyünə otolog pulposus nüvəsinin implantasiyası ilə yaradılmışdır. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. və Boos, N. Lomber onurğanın maqnit rezonans görüntüləməsi: asemptomatik könüllülərdə disk yırtığının və tutulmasının yayılması, sinir kökünün sıxılması, son boşqab anomaliyaları və faset birgə osteoartrit . dərəcəsi. Radiologiya 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS və Leboeuf-Eed, K. Modic dəyişiklikləri və onların klinik tapıntılarla əlaqəsi. Avropa Onurğa Jurnalı: Avropa Onurğa Cəmiyyətinin, Avropa Onurğa Deformasiyası Cəmiyyətinin və Avropa Servikal Onurğa Araşdırmaları Cəmiyyətinin rəsmi nəşri 15, 1312-1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Lomber vertebral son lövhələrdə modik dəyişikliklər: orta yaşlı kişi işçilərdə aşağı bel ağrısı və siyatik ilə yayılma və birləşmə. Onurğa 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. və Dalinka, M. Sümük iliyinin MRT-si belin degenerativ xəstəliyində son boşqabın yaxınlığında dəyişir. AJR. American Journal of Radiology 149, 531-534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ və Carter, JR Degenerativ disk xəstəliyi: MRT ilə vertebral ilik dəyişikliklərinin qiymətləndirilməsi. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS və Carter, JR Degenerativ disk xəstəliyinin görüntüsü. Radiologiya 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Ümumi populyasiyada neovertebral endplate (Modic) siqnal dəyişikliklərinin proqnozlaşdırıcıları. Avropa Onurğa Jurnalı: Avropa Onurğa Cəmiyyətinin, Avropa Onurğa Deformasiyası Cəmiyyətinin və Avropa Servikal Onurğa Araşdırmaları Cəmiyyətinin Rəsmi Nəşri, Bölmə 19, 129-135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB və Mannisch, K. Modic lomber disk yırtığından sonra dəyişir. Avropa Onurğa Jurnalı: Avropa Onurğa Cəmiyyətinin, Avropa Onurğa Deformasiyası Cəmiyyətinin və Avropa Servikal Onurğa Araşdırmaları Cəmiyyətinin rəsmi nəşri 16, 977-982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. və Kaapa, E. Modic tip I dəyişiklikləri sürətlə mütərəqqi deformasiyalı disk degenerasiyasını proqnozlaşdıra bilər: 1 illik perspektiv tədqiqat. European Spine Journal 21, 1135-1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ və Fan, SW Modic dəyişiklikləri: mümkün səbəblər və lomber disk degenerasiyasına töhfə. Tibbi Hipotezlər 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Daxili disk yırtığı. 50 il ərzində disk prolaps problemləri. Onurğa (Phila Pa 1976) 11, 650-653 (1986).
Göndərmə vaxtı: 13 dekabr 2024-cü il