nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var. Ən yaxşı təcrübə üçün ən son brauzer versiyasından istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini deaktiv etməyi) tövsiyə edirik. Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün bu sayt üslublardan və JavaScript-dən azad olacaq.
Skelet əzələsi əsasən miofibrillərdən ibarət heterojen bir toxumadır və insanlarda bu liflər adətən üç növə bölünür: biri "yavaş" (tip 1) və ikisi "sürətli" (tip 2A və 2X). Bununla belə, ənənəvi miofibril növləri arasında və daxilində heterojenlik hələ də zəif başa düşülür. Biz müvafiq olaraq insan vastus lateralis-dən 1050 və 1038 fərdi miofibrillərə transkriptomik və proteomik yanaşmalar tətbiq etdik. Proteomik tədqiqata kişilər, transkriptomik tədqiqata isə 10 kişi və 2 qadın daxil idi. Miozin ağır zəncir izoformlarına əlavə olaraq, metabolik zülalları, ribosomal zülalları və hüceyrə birləşmə zülallarını çoxölçülü intermiofibril dəyişkənliyinin mənbələri kimi müəyyən etdik. Bundan əlavə, yavaş və sürətli liflər qruplarının müəyyən edilməsinə baxmayaraq, məlumatlarımız göstərir ki, 2X tipli liflər digər sürətli bükülmə liflərindən fenotipik olaraq fərqlənmir. Bundan əlavə, miozin ağır zəncir əsaslı təsnifat nemalin miyopatiyalarında miofibril fenotipini təsvir etmək üçün kifayət deyil. Ümumilikdə, məlumatlarımız çoxölçülü miyofiber heterojenliyini göstərir və variasiya mənbələri miyozin ağır zəncir izoformlarından kənara çıxır.
Hüceyrə heterojenliyi bütün bioloji sistemlərin ayrılmaz xüsusiyyətidir və hüceyrələrin toxumaların və hüceyrələrin müxtəlif ehtiyaclarını ödəmək üçün ixtisaslaşmasına imkan verir.1 Skelet əzələ liflərinin heterojenliyinə dair ənənəvi baxış, motor neyronlarının motor vahidi daxilində lif növünü təyin etməsi və lif növünün (yəni insanlarda 1-ci tip, 2A tip və 2X tip) miozin ağır zəncirli (MYH) izoformlarının xüsusiyyətləri ilə müəyyən edilməsidir.2 Bu, əvvəlcə onların pH ATFaza qeyri-sabitliyinə,3,4 və daha sonra MYH-nin molekulyar ifadəsinə əsaslanırdı.5 Lakin, müxtəlif nisbətlərdə çoxlu MYH-ləri birgə ifadə edən "qarışıq" liflərin müəyyən edilməsi və sonradan qəbul edilməsi ilə skelet əzələ lifləri getdikcə fərqli lif növləri kimi deyil, davamlı bir lif kimi qəbul edilir.6 Buna baxmayaraq, sahə hələ də miofiber təsnifatı üçün əsas təsnifatçı kimi MYH-yə çox güvənir, bu baxış, ehtimal ki, MYH ifadə profilləri və lif növlərinin diapazonu insanlardakından fərqlənən erkən gəmirici tədqiqatlarının məhdudiyyətləri və əhəmiyyətli qərəzlərindən təsirlənmişdir.2 Vəziyyət, müxtəlif insan skelet əzələlərinin müxtəlif lif növləri nümayiş etdirməsi ilə daha da mürəkkəbləşir.7 Vastus lateralis, orta (və buna görə də təmsilçi) MYH ifadə profilinə malik qarışıq əzələdir.7 Bundan əlavə, nümunə götürmə asanlığı onu insanlarda ən yaxşı öyrənilən əzələ halına gətirir.
Beləliklə, güclü "omics" alətlərindən istifadə edərək skelet əzələ liflərinin müxtəlifliyinin qərəzsiz tədqiqi vacib, eyni zamanda çətin məsələdir, qismən skelet əzələ liflərinin çoxnüvəli təbiətinə görə. Lakin, son illərdə müxtəlif texnoloji irəliləyişlər səbəbindən transkriptomika8,9 və proteomika10 texnologiyaları həssaslıqda inqilab yaşamış və skelet əzələlərinin tək lifli həllində təhlilinə imkan vermişdir. Nəticədə, tək lifli müxtəlifliyin və onların atrofik stimullara və yaşlanmaya qarşı reaksiyasının xarakteristikasında əhəmiyyətli irəliləyiş əldə edilmişdir11,12,13,14,15,16,17,18. Əhəmiyyətli olan odur ki, bu texnoloji irəliləyişlər klinik tətbiqlərə malikdir və xəstəliklə əlaqəli disrequlyasiyanın daha ətraflı və dəqiq xarakteristikasına imkan verir. Məsələn, ən çox yayılmış irsi əzələ xəstəliklərindən biri olan nemalin miopatiyasının patofiziologiyası (MIM 605355 və MIM 161800) mürəkkəb və çaşdırıcıdır.19,20 Buna görə də, skelet əzələ liflərinin disrequlyasiyasının daha yaxşı xarakteristikası bu xəstəliyi anlamağımızda əhəmiyyətli irəliləyişlərə səbəb ola bilər.
İnsan biopsiyası nümunələrindən əl ilə təcrid olunmuş tək skelet əzələ liflərinin transkriptomik və proteomik analiz metodları hazırladıq və onları minlərlə lifə tətbiq etdik ki, bu da insan skelet əzələ liflərinin hüceyrə heterojenliyini araşdırmağa imkan verdi. Bu iş zamanı əzələ liflərinin transkriptomik və proteomik fenotipləşdirilməsinin gücünü nümayiş etdirdik və metabolik, ribosomal və hüceyrə birləşmə zülallarını liflərarası dəyişkənliyin əhəmiyyətli mənbələri kimi müəyyən etdik. Bundan əlavə, bu proteomik iş axınından istifadə edərək tək skelet əzələ liflərində nematod miopatiyasının klinik əhəmiyyətini xarakterizə etdik və MYH-yə əsaslanan lif növündən asılı olmayaraq oksidləşdirici olmayan liflərə doğru koordinasiyalı bir dəyişikliyi aşkar etdik.
İnsan skelet əzələ liflərinin heterojenliyini araşdırmaq üçün tək skelet əzələ liflərinin transkriptom və proteom analizini təmin etmək üçün iki iş axını hazırladıq (Şəkil 1A və Əlavə Şəkil 1A). Nümunənin saxlanmasından və RNT və zülal bütövlüyünün qorunmasından tutmuş hər bir yanaşma üçün ötürmə qabiliyyətinin optimallaşdırılmasına qədər bir neçə metodoloji addım hazırladıq və optimallaşdırdıq. Transkriptom analizi üçün bu, tərs transkripsiyanın ilkin mərhələsində nümunəyə xas molekulyar barkodların daxil edilməsi ilə əldə edildi və bu da səmərəli aşağı axın emalı üçün 96 lifin birləşdirilməsinə imkan verdi. Ənənəvi tək hüceyrəli yanaşmalarla müqayisədə daha dərin ardıcıllıq (hər lif üçün ±1 milyon oxunuş) transkriptom məlumatlarını daha da zənginləşdirdi.21 Proteomika üçün yüksək ötürmə qabiliyyətini qoruyarkən proteom dərinliyini optimallaşdırmaq üçün timsTOF kütlə spektrometrində DIA-PASEF məlumatlarının toplanması ilə birləşdirilmiş qısa xromatoqrafik qradiyentdən (21 dəqiqə) istifadə etdik. 22,23 Sağlam skelet əzələ liflərinin heterojenliyini araşdırmaq üçün 14 sağlam yetkin donordan 1050 fərdi lifin transkriptomlarını və 5 sağlam yetkin donordan 1038 lifin proteomlarını xarakterizə etdik (Əlavə Cədvəl 1). Bu məqalədə bu məlumat dəstləri müvafiq olaraq 1000 lifli transkriptom və proteom adlanır. Bizim yanaşmamız 1000 lifli transkriptomik və proteom analizlərində cəmi 27237 transkript və 2983 zülal aşkar etdi (Şəkil 1A, Əlavə Məlumat Dəstləri 1-2). Transkriptomik və proteom məlumat dəstlərini >1000 aşkar edilmiş gen və lif başına 50% etibarlı dəyərlər üçün süzgəcdən keçirdikdən sonra, müvafiq olaraq transkriptom və proteomdakı 925 və 974 lif üçün sonrakı bioinformatika analizləri aparıldı. Filtrdən sonra, hər lif üçün orta hesabla 4257 ± 1557 gen və 2015 ± 234 zülal (orta ± SD) aşkar edildi və fərdlərarası dəyişkənlik məhdud idi (Əlavə Şəkillər 1B–C, Əlavə Məlumat Dəstləri 3–4). Lakin, subyektdaxili dəyişkənlik iştirakçılar arasında daha çox nəzərə çarpırdı, bu, ehtimal ki, müxtəlif uzunluqlu və en kəsik sahəli liflər arasında RNT/zülal məhsuldarlığındakı fərqlərə görə idi. Əksər zülallar üçün (>2000) variasiya əmsalı 20%-dən aşağı idi (Əlavə Şəkil 1D). Hər iki üsul əzələ daralması üçün vacib olan yüksək ifadə olunmuş imzalara malik transkriptlərin və zülalların geniş dinamik diapazonunu (məsələn, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) tutmağa imkan verdi (Əlavə Şəkillər 1E–F). Müəyyən edilmiş xüsusiyyətlərin əksəriyyəti transkriptomik və proteomik məlumat dəstləri arasında ortaq idi (Əlavə Şəkil 1G) və bu xüsusiyyətlərin orta UMI/LFQ intensivliyi kifayət qədər yaxşı korrelyasiya olunmuşdu (r = 0.52) (Əlavə Şəkil 1H).
Transkriptomika və proteomika iş axını (BioRender.com ilə yaradılmışdır). BD MYH7, MYH2 və MYH1 üçün dinamik diapazon əyriləri və lif tipinin təyin edilməsi üçün hesablanmış hədlər. E, F Transkriptomika və proteomika məlumat dəstlərində MYH ifadəsinin liflər arasında paylanması. G, H MYH əsaslı lif tipinə görə rənglənmiş transkriptomika və proteomika üçün Vahid Müxtəliflik Yaxınlaşması və Proyeksiyası (UMAP) qrafikləri. I, J Transkriptomika və proteomika məlumat dəstlərində MYH7, MYH2 və MYH1 ifadəsini göstərən xüsusiyyət qrafikləri.
Əvvəlcə omics məlumat dəstlərində MYH ifadəsinin yüksək həssaslığından və dinamik diapazonundan istifadə edən optimallaşdırılmış bir yanaşma istifadə edərək hər bir lifə MYH əsaslı lif növü təyin etməyə başladıq. Əvvəlki tədqiqatlarda lifləri təmiz tip 1, tip 2A, tip 2X və ya müxtəlif MYH-lərin sabit ifadə faizinə əsasən qarışıq kimi etiketləmək üçün ixtiyari eşiklərdən istifadə edilmişdir11,14,24. Hər bir lifin ifadəsinin lifləri tipləşdirmək üçün istifadə etdiyimiz MYH-lər tərəfindən sıralandığı fərqli bir yanaşmadan istifadə etdik: MYH7, MYH2 və MYH1, müvafiq olaraq 1, tip 2A və tip 2X liflərinə uyğundur. Daha sonra hər bir yaranan əyrinin aşağı əyilmə nöqtəsini riyazi olaraq hesabladıq və hər bir MYH üçün lifləri müsbət (eşikdən yuxarı) və ya mənfi (eşikdən aşağı) olaraq təyin etmək üçün eşik kimi istifadə etdik (Şəkil 1B–D). Bu məlumatlar göstərir ki, MYH7 (Şəkil 1B) və MYH2 (Şəkil 1C) zülal səviyyəsi ilə müqayisədə RNT səviyyəsində daha fərqli açma/bağlama ifadə profillərinə malikdir. Həqiqətən də, zülal səviyyəsində çox az lif MYH7 ifadə etmirdi və heç bir lif 100% MYH2 ifadəsinə malik deyildi. Daha sonra hər bir məlumat dəstindəki bütün liflərə MYH əsaslı lif növlərini təyin etmək üçün əvvəlcədən müəyyən edilmiş ifadə hədlərindən istifadə etdik. Məsələn, MYH7+/MYH2-/MYH1- liflər 1-ci tipə, MYH7-/MYH2+/MYH1+ liflər isə qarışıq 2A/2X tipə təyin edildi (tam təsvir üçün Əlavə Cədvəl 2-yə baxın). Bütün lifləri birləşdirərək, həm RNT (Şəkil 1E), həm də zülal (Şəkil 1F) səviyyələrində MYH əsaslı lif növlərinin olduqca oxşar paylanmasını müşahidə etdik, MYH əsaslı lif növlərinin nisbi tərkibi isə gözlənildiyi kimi fərdlər arasında dəyişdi (Əlavə Şəkil 2A). Əksər liflər ya təmiz tip 1 (34-35%), ya da 2A tip (36-38%) kimi təsnif edildi, baxmayaraq ki, xeyli sayda qarışıq tip 2A/2X lifləri də aşkar edildi (16-19%). Təəccüblü bir fərq, təmiz tip 2X liflərinin yalnız RNT səviyyəsində aşkar edilə bilməsi, lakin zülal səviyyəsində aşkar edilə bilməməsidir ki, bu da sürətli MYH ifadəsinin transkripsiyadan sonra ən azı qismən tənzimləndiyini göstərir.
Proteomika əsaslı MYH lif tipləşdirmə metodumuzu antikor əsaslı nöqtə ləkələməsindən istifadə edərək təsdiqlədik və hər iki metod təmiz 1-ci tip və 2A tip liflərin müəyyən edilməsində 100% uyğunluq əldə etdi (Əlavə Şəkil 2B-yə baxın). Lakin, proteomika əsaslı yanaşma daha həssas, qarışıq liflərin müəyyən edilməsində və hər bir lifdəki hər bir MYH geninin nisbətinin ölçülməsində daha səmərəli idi. Bu məlumatlar skelet əzələ liflərinin növlərini xarakterizə etmək üçün obyektiv, yüksək həssaslıqlı omikaya əsaslanan yanaşmanın istifadəsinin effektivliyini nümayiş etdirir.
Daha sonra transkriptomika və proteomika tərəfindən təqdim edilən birləşdirilmiş məlumatlardan istifadə edərək miyofiberləri tam transkriptom və ya proteomlarına əsasən obyektiv şəkildə təsnif etdik. Ölçülüyü altı əsas komponentə endirmək üçün vahid manifold yaxınlaşma və proyeksiya (UMAP) metodundan istifadə edərək (Əlavə Şəkillər 3A–B), transkriptomda (Şəkil 1G) və proteomda (Şəkil 1H) miyofiber dəyişkənliyini vizuallaşdıra bildik. Qeyd etmək lazımdır ki, miyofiberlər nə transkriptomika, nə də proteomika məlumat dəstlərində iştirakçılara (Əlavə Şəkillər 3C–D), nə də sınaq günlərinə (Əlavə Şəkil 3E) görə qruplaşdırılmamışdır ki, bu da skelet əzələ liflərində subyektdaxili dəyişkənliyin subyektlərarası dəyişkənlikdən daha yüksək olduğunu göstərir. UMAP qrafikində "sürətli" və "yavaş" miyofiberləri təmsil edən iki fərqli klaster ortaya çıxdı (Şəkillər 1G–H). MYH7+ (yavaş) miyofiberlər UMAP1-in müsbət qütbündə, MYH2+ və MYH1+ (sürətli) miyofiberlər isə UMAP1-in mənfi qütbündə klasterləşdirilmişdir (Şəkil 1I–J). Lakin, MYH ifadəsinə əsasən sürətli büzülən lif növləri (yəni 2A tipi, 2X tipi və ya qarışıq 2A/2X) arasında heç bir fərq qoyulmamışdır ki, bu da MYH1 (Şəkil 1I–J) və ya ACTN3 və ya MYLK2 (Əlavə Şəkillər 4A–B) kimi digər klassik 2X miyofiber markerlərinin ifadəsinin bütün transkriptom və ya proteom nəzərə alındıqda müxtəlif miyofiber növləri arasında fərq qoymadığını göstərir. Bundan əlavə, MYH2 və MYH7 ilə müqayisədə az sayda transkript və ya zülal MYH1 ilə müsbət korrelyasiya olunmuşdur (Əlavə Şəkillər 4C–H), bu da MYH1 bolluğunun miyofiber transkriptom/proteomu tam əks etdirmədiyini göstərir. UMAP səviyyəsində üç MYH izoformasının qarışıq ifadəsini qiymətləndirərkən oxşar nəticələr əldə edilmişdir (Əlavə Şəkil 4I–J). Beləliklə, 2X lifləri yalnız MYH kəmiyyətləndirməsinə əsasən transkript səviyyəsində müəyyən edilə bilsə də, MYH1+ lifləri bütün transkriptomu və ya proteomu nəzərdən keçirərkən digər sürətli liflərdən fərqlənmir.
MYH-dən kənarda yavaş lif heterojenliyinin ilkin tədqiqi olaraq, biz dörd müəyyən edilmiş yavaş lif tipinə xas zülalları qiymətləndirdik: TPM3, TNNT1, MYL3 və ATP2A22. Yavaş lif alt tipləri həm transkriptomikada (Əlavə Şəkil 5A), həm də proteomikada (Əlavə Şəkil 5B) MYH7 ilə Pearson korrelyasiyalarını yüksək, lakin mükəmməl göstərmədi. Yavaş liflərin təxminən 25% və 33%-i transkriptomikada (Əlavə Şəkil 5C) və proteomikada (Əlavə Şəkil 5D) bütün gen/zülal alt tipləri tərəfindən təmiz yavaş liflər kimi təsnif edilməmişdir. Buna görə də, birdən çox gen/zülal alt tiplərinə əsaslanan yavaş lif təsnifatı, hətta lif tipinə xas olduğu bilinən zülallar üçün də əlavə mürəkkəblik yaradır. Bu, tək bir gen/zülal ailəsinin izoformlarına əsaslanan lif təsnifatının skelet əzələ liflərinin əsl heterojenliyini kifayət qədər əks etdirmədiyini göstərir.
Bütün omiks modelinin miqyasında insan skelet əzələ liflərinin fenotipik dəyişkənliyini daha da araşdırmaq üçün, əsas komponent təhlili (PCA) istifadə edərək məlumatların qərəzsiz ölçülü azaldılmasını həyata keçirdik (Şəkil 2A). UMAP qrafiklərinə bənzər şəkildə, nə iştirakçı, nə də sınaq günü PCA səviyyəsində lif klasterləşməsinə təsir göstərmədi (Əlavə Şəkillər 6A–C). Hər iki məlumat dəstində MYH əsaslı lif növü PC2 ilə izah edildi, bu da yavaş büzülən 1-ci tip liflər qrupunu və sürətli büzülən 2A, 2X tip və qarışıq 2A/2X lifləri ehtiva edən ikinci bir qrupu göstərdi (Şəkil 2A). Hər iki məlumat dəstində bu iki qrup az sayda qarışıq 1/2A tip liflərlə birləşdirildi. Gözlənildiyi kimi, əsas PC sürücülərinin həddindən artıq təmsilçilik təhlili PC2-nin yığılma və metabolik imzalarla idarə olunduğunu təsdiqlədi (Şəkil 2B və Əlavə Şəkillər 6D–E, Əlavə Məlumat Dəstləri 5–6). Ümumilikdə, sürətli klaster daxilində transkriptom boyunca paylanmış sözdə 2X lifləri istisna olmaqla, MYH əsaslı lif növünün PC2 boyunca davamlı variasiyanı izah etmək üçün kifayət olduğu aşkar edilmişdir.
A. MYH-yə əsaslanaraq lif növünə görə rənglənmiş transkriptom və proteom məlumat dəstlərinin əsas komponent analizi (PCA) qrafikləri. B. PC2 və PC1-də transkript və zülal sürücülərinin zənginləşdirmə təhlili. Statistik analiz clusterProfiler paketi və Benjamini-Hochberg tənzimlənmiş p-dəyərləri istifadə edilərək aparılmışdır. C, D. Transkriptomda hüceyrələrarası adgeziya gen ontologiyası (GO) terminlərinə və proteomda kostamer GO terminlərinə görə rənglənmiş PCA qrafikləri. Oxlar transkript və zülal sürücülərini və onların istiqamətlərini təmsil edir. E, F. Yavaş/sürətli lif növündən asılı olmayan ifadə qradiyentlərini göstərən klinik cəhətdən əhəmiyyətli xüsusiyyətlərin vahid manifold yaxınlaşması və proyeksiyası (UMAP) xüsusiyyət qrafikləri. G, H. Transkriptomlarda və proteomlarda PC2 və PC1 sürücüləri arasındakı korrelyasiyalar.
Gözlənilmədən, MYH əsaslı miyofiber tipi yalnız ikinci ən yüksək dəyişkənlik dərəcəsini (PC2) izah etdi və bu da MYH əsaslı miyofiber tipi (PC1) ilə əlaqəsi olmayan digər bioloji amillərin skelet əzələ lifinin heterojenliyinin tənzimlənməsində mühüm rol oynadığını göstərir. PC1-də ən yaxşı sürücülərin həddindən artıq təmsilçilik təhlili PC1-də dəyişkənliyin əsasən hüceyrə-hüceyrə adgeziyası və transkriptomdakı ribosom tərkibi, proteomdakı kostamerlər və ribosomal zülallar tərəfindən müəyyən edildiyini göstərdi (Şəkil 2B və Əlavə Şəkillər 6D–E, Əlavə Məlumat Dəsti 7). Skelet əzələsində kostamerlər Z-diskini sarkolemma ilə birləşdirir və güc ötürülməsində və siqnalında iştirak edir. 25 Hüceyrə-hüceyrə adgeziyası (transkriptom, Şəkil 2C) və kostamer (proteom, Şəkil 2D) xüsusiyyətlərindən istifadə edərək şərh edilmiş PCA qrafikləri PC1-də güclü sola sürüşməni aşkar etdi ki, bu da bu xüsusiyyətlərin müəyyən liflərlə zəngin olduğunu göstərir.
UMAP səviyyəsində miyofiber klasterləşməsinin daha ətraflı araşdırılması göstərdi ki, əksər xüsusiyyətlər miyofiber altklasterinə xas deyil, miyofiber növündən asılı olmayan MYH əsaslı ifadə qradiyenti nümayiş etdirir. Bu davamlılıq CHCHD10 (neyromuskulyar xəstəlik), SLIT3 (əzələ atrofiyası), CTDNEP1 (əzələ xəstəliyi) kimi patoloji vəziyyətlərlə əlaqəli bir neçə gen üçün müşahidə edilmişdir (Şəkil 2E). Bu davamlılıq, nevroloji xəstəliklər (UGDH), insulin siqnalizasiyası (PHIP) və transkripsiya (HIST1H2AB) ilə əlaqəli zülallar da daxil olmaqla, proteom boyunca da müşahidə edilmişdir (Şəkil 2F). Ümumilikdə, bu məlumatlar müxtəlif miyofiberlər arasında lif növündən asılı olmayan yavaş/sürətli bükülmə heterojenliyində davamlılığı göstərir.
Maraqlıdır ki, PC2-də sürücü genləri yaxşı transkriptom-proteom korrelyasiyasını göstərdi (r = 0.663) (Şəkil 2G), bu da yavaş və sürətli büzülmə lif növlərinin, xüsusən də skelet əzələ liflərinin yığılma və metabolik xüsusiyyətlərinin transkripsiya baxımından tənzimləndiyini göstərir. Lakin, PC1-də sürücü genləri heç bir transkriptom-proteom korrelyasiyasını göstərmədi (r = -0.027) (Şəkil 2H), bu da yavaş/sürətli büzülmə lif növlərinə aid olmayan variasiyaların transkripsiyadan sonra əsasən tənzimləndiyini göstərir. PC1-dəki variasiyalar əsasən ribosomal gen ontologiyası terminləri ilə izah edildiyindən və ribosomların zülal tərcüməsində fəal iştirak edərək və təsir göstərərək hüceyrədə mühüm və ixtisaslaşmış rol oynadığını nəzərə alsaq,31, daha sonra bu gözlənilməz ribosomal heterojenliyi araşdırmağa başladıq.
Əvvəlcə proteomikanın əsas komponent analiz qrafikini GOCC "sitoplazmatik ribosom" terminindəki zülalların nisbi bolluğuna görə rənglədik (Şəkil 3A). Bu termin PC1-in müsbət tərəfində zənginləşsə də, kiçik bir qradiyentə səbəb olsa da, ribosomal zülallar PC1-in hər iki istiqamətində bölünməyə səbəb olur (Şəkil 3A). PC1-in mənfi tərəfində zənginləşən ribosomal zülallara RPL18, RPS18 və RPS13 (Şəkil 3B), RPL31, RPL35 və RPL38 (Şəkil 3C) isə PC1-in müsbət tərəfindəki əsas hərəkətverici qüvvələr idi. Maraqlıdır ki, RPL38 və RPS13 digər toxumalarla müqayisədə skelet əzələlərində yüksək dərəcədə ifadə olunmuşdur (Əlavə Şəkil 7A). PC1-dəki bu fərqli ribosomal imzalar transkriptomda müşahidə edilməmişdir (Əlavə Şəkil 7B), bu da transkripsiyadan sonrakı tənzimləməni göstərir.
A. Proteom boyunca sitoplazmatik ribosomal gen ontologiyası (GO) terminlərinə uyğun olaraq rənglənmiş əsas komponent analizi (PCA) qrafiki. Oxlar PCA qrafikində zülal vasitəçiliyi ilə dəyişmənin istiqamətini göstərir. Xətt uzunluğu müəyyən bir zülal üçün əsas komponent balına uyğundur. B, C. PCA RPS13 və RPL38 üçün qrafiklərə malikdir. D. Sitoplazmatik ribosomal zülalların nəzarətsiz iyerarxik klasterləşmə təhlili. E. Skelet əzələ liflərində fərqli bolluqlara malik ribosomal zülalları vurğulayan 80S ribosomunun (PDB: 4V6X) struktur modeli. F. mRNT çıxış kanalının yaxınlığında lokallaşdırılmış fərqli stexiometriyaya malik ribosomal zülallar.
Ribosomal heterojenlik və ixtisaslaşma anlayışları əvvəllər təklif edilmişdir ki, burada fərqli ribosom alt populyasiyalarının (ribosomal heterojenlik) mövcudluğu spesifik mRNA transkript hovuzlarının 34 selektiv tərcüməsi (ribosom ixtisaslaşması) vasitəsilə müxtəlif toxumalarda32 və hüceyrələrdə33 zülal tərcüməsinə birbaşa təsir göstərə bilər. Skelet əzələ liflərində birgə ifadə olunan ribosomal zülalların alt populyasiyalarını müəyyən etmək üçün proteomdakı ribosomal zülalların nəzarətsiz iyerarxik klasterləşmə təhlili apardıq (Şəkil 3D, Əlavə Məlumat Dəsti 8). Gözlənildiyi kimi, ribosomal zülallar MYH-yə əsasən lif növünə görə klasterləşməmişdir. Lakin, ribosomal zülalların üç fərqli klasterini müəyyən etdik; birinci klaster (ribosomal_kluster_1) RPL38 ilə korrequlyasiya olunur və buna görə də müsbət PC1 profilinə malik liflərdə ifadə artmışdır. İkinci klaster (ribosomal_kluster_2) RPS13 ilə korrequlyasiya olunur və mənfi PC1 profilinə malik liflərdə yüksəlmişdir. Üçüncü klaster (ribosomal_cluster_3) skelet əzələ liflərində koordinasiyalı diferensial ifadə göstərmir və "əsas" skelet əzələ ribosomal zülalı hesab edilə bilər. Hər iki ribosomal klaster 1 və 2 əvvəllər alternativ tərcüməni tənzimlədiyi (məsələn, RPL10A, RPL38, RPS19 və RPS25) və funksional olaraq inkişafa təsir etdiyi (məsələn, RPL10A, RPL38) göstərilən ribosomal zülalları ehtiva edir.34,35,36,37,38 PCA nəticələrinə uyğun olaraq, bu ribosomal zülalların liflər arasında müşahidə olunan heterojen təmsilçiliyi də davamlılıq göstərdi (Əlavə Şəkil 7C).
Ribosomal zülalların ribosom daxilində yerini vizuallaşdırmaq üçün insan 80S ribosomunun struktur modelindən (Zülal Məlumat Bankı: 4V6X) istifadə etdik (Şəkil 3E). Müxtəlif ribosomal qruplara aid ribosomal zülalları təcrid etdikdən sonra onların yerləri bir-birinə yaxın deyildi, bu da yanaşmamızın ribosomun müəyyən bölgələri/fraksiyaları üçün zənginləşdirmə təmin edə bilmədiyini göstərir. Lakin maraqlıdır ki, 2-ci qrupdakı böyük alt vahid zülalların nisbəti 1 və 3-cü qruplara nisbətən daha aşağı idi (Əlavə Şəkil 7D). Skelet əzələ liflərində dəyişdirilmiş stexiometriyaya malik zülalların əsasən ribosom səthində lokallaşdırıldığını müşahidə etdik (Şəkil 3E), bu da onların müxtəlif mRNT populyasiyalarında daxili ribosom giriş yeri (IRES) elementləri ilə qarşılıqlı təsir göstərmək qabiliyyətinə uyğundur və bununla da selektiv tərcüməni əlaqələndirir. 40, 41 Bundan əlavə, skelet əzələ liflərində dəyişdirilmiş stexiometriyaya malik bir çox zülal, məsələn, spesifik peptidlərin translyasiya uzanmasını və dayandırılmasını selektiv şəkildə tənzimləyən mRNT çıxış tuneli (Şəkil 3F) kimi funksional bölgələrin yaxınlığında yerləşirdi. 42 Xülasə, məlumatlarımız göstərir ki, skelet əzələlərinin ribosomal zülallarının stexiometriyası heterojenlik nümayiş etdirir və bu da skelet əzələ lifləri arasında fərqlərə səbəb olur.
Daha sonra sürətli və yavaş büzülən lif imzalarını müəyyən etməyə və onların transkripsiya tənzimlənməsi mexanizmlərini araşdırmağa başladıq. İki məlumat dəstində (Şəkil 1G–H və 4A–B) UMAP tərəfindən təyin edilən sürətli və yavaş büzülən lif klasterlərini müqayisə edərək, transkriptomik və proteomik təhlillər müvafiq olaraq 1366 və 804 fərqli bolluq xüsusiyyətləri müəyyən etdi (Şəkil 4A–B, Əlavə Məlumat Dəstləri 9–12). Sarkomerlərlə (məsələn, tropomiozin və troponin), həyəcanlanma-sıxılma birləşməsi (SERCA izoformları) və enerji metabolizması (məsələn, ALDOA və CKB) ilə əlaqəli imzalarda gözlənilən fərqləri müşahidə etdik. Bundan əlavə, zülal ubikvitinasiyasını tənzimləyən transkriptlər və zülallar sürətli və yavaş büzülən liflərdə (məsələn, USP54, SH3RF2, USP28 və USP48) fərqli şəkildə ifadə edildi (Şəkil 4A–B). Bundan əlavə, əvvəllər quzu əzələ lifi növləri43 arasında fərqli şəkildə ifadə edildiyi və ürək əzələsində44 SERCA aktivliyini artırdığı göstərilən mikrob zülal geni RP11-451G4.2 (DWORF) yavaş skelet əzələ liflərində əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlmişdir (Şəkil 4A). Eynilə, fərdi lif səviyyəsində metabolizmlə əlaqəli laktat dehidrogenaza izoformları (LDHA və LDHB, Şəkil 4C və Əlavə Şəkil 8A)45,46 kimi məlum imzalarda, eləcə də əvvəllər məlum olmayan lif tipinə xas imzalarda (məsələn, IRX3, USP54, USP28 və DPYSL3) əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edilmişdir (Şəkil 4C). Transkriptomik və proteomik məlumat dəstləri arasında fərqli şəkildə ifadə olunan xüsusiyyətlərin əhəmiyyətli dərəcədə üst-üstə düşməsi (Əlavə Şəkil 8B), eləcə də əsasən sarkomer xüsusiyyətlərinin daha aydın diferensial ifadəsi ilə idarə olunan qat dəyişikliyi korrelyasiyası mövcud idi (Əlavə Şəkil 8C). Xüsusilə, bəzi imzalar (məsələn, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) yalnız proteomik səviyyədə güclü post-transkripsiya tənzimləməsi göstərmiş və yavaş/sürətli büzüşmə lifinin tipinə xas ifadə profillərinə malik olmuşdur (Əlavə Şəkil 8C).
Şəkil 1G–H-də vahid manifold yaxınlaşması və proyeksiyası (UMAP) qrafikləri ilə müəyyən edilmiş yavaş və sürətli klasterləri müqayisə edən A və B vulkan qrafikləri. Rəngli nöqtələr FDR < 0.05-də əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olan transkriptləri və ya zülalları, daha tünd nöqtələr isə loqarifmik dəyişiklik > 1-də əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olan transkriptləri və ya zülalları təmsil edir. İki tərəfli statistik analiz Benjamini-Hochberg tənzimlənmiş p dəyərləri (transkriptomika) ilə DESeq2 Wald testi və ya çoxsaylı müqayisələr üçün Benjamini-Hochberg tənzimlənməsi (proteomika) ilə empirik Bayes analizi ilə Limma xətti model metodu istifadə edilərək aparılmışdır. C Yavaş və sürətli liflər arasında seçilmiş diferensial ifadə olunmuş genlərin və ya zülalların imza qrafikləri. D Əhəmiyyətli dərəcədə diferensial ifadə olunmuş transkriptlərin və zülalların zənginləşdirmə təhlili. Üst-üstə düşən dəyərlər hər iki məlumat dəstində zənginləşdirilmişdir, transkriptom dəyərləri yalnız transkriptomda, proteom dəyərləri isə yalnız proteomda zənginləşdirilmişdir. Statistik analiz Benjamini-Hochberg tənzimlənmiş p-dəyərləri ilə clusterProfiler paketi istifadə edilərək aparılmışdır. E. SCENIC tərəfindən SCENIC-dən əldə edilən tənzimləyici spesifiklik ballarına və lif növləri arasında diferensial mRNT ifadəsinə əsasən müəyyən edilmiş lif tipinə xas transkripsiya amilləri. F. Yavaş və sürətli liflər arasında diferensial ifadə olunmuş seçilmiş transkripsiya amillərinin profillənməsi.
Daha sonra fərqli şəkildə təmsil olunan genlərin və zülalların həddindən artıq təmsilçilik təhlilini apardıq (Şəkil 4D, Əlavə Məlumat Dəsti 13). İki məlumat dəsti arasında fərqlənən xüsusiyyətlər üçün yol zənginləşdirilməsi gözlənilən fərqləri, məsələn, yağ turşusu β-oksidləşməsi və keton metabolizması prosesləri (yavaş liflər), miofilament/əzələ daralması (müvafiq olaraq sürətli və yavaş liflər) və karbohidrat katabolik prosesləri (sürətli liflər) aşkar etdi. Serin/treonin protein fosfataza aktivliyi də sürətli liflərdə yüksəlmişdir ki, bu da qlikogen metabolizmasını tənzimlədiyi bilinən tənzimləyici və katalitik fosfataza alt vahidləri (PPP3CB, PPP1R3D və PPP1R3A) kimi xüsusiyyətlərdən irəli gəlir (47) (Əlavə Şəkillər 8D–E). Sürətli liflərlə zənginləşdirilmiş digər yollara proteomdakı emal (P-) cisimləri (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (Əlavə Şəkil 8F), potensial olaraq transkripsiya sonrası tənzimləmədə iştirak edir (48) və transkriptomdakı transkripsiya faktoru aktivliyi (SREBF1, RXRG, RORA) (Əlavə Şəkil 8G) daxildir. Yavaş liflər oksidoreduktaza aktivliyi (BDH1, DCXR, TXN2) (Əlavə Şəkil 8H), amid bağlanması (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Əlavə Şəkil 8I), hüceyrədənkənar matris (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Əlavə Şəkil 8J) və reseptor-liqand aktivliyi (FNDC5, SPX, NENF) ilə zənginləşdirilmişdir (Əlavə Şəkil 8K).
Yavaş/sürətli əzələ lifi tip xüsusiyyətlərinin əsasını təşkil edən transkripsiya tənzimlənməsi haqqında daha çox məlumat əldə etmək üçün SCENIC49 (Əlavə Məlumat Dəsti 14) istifadə edərək transkripsiya faktorunun zənginləşdirilməsi təhlili apardıq. Bir çox transkripsiya faktoru sürətli və yavaş əzələ lifləri arasında əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmişdir (Şəkil 4E). Buraya əvvəllər sürətli əzələ lifinin inkişafı ilə əlaqəli olan MAFA kimi transkripsiya faktorları,50 eləcə də əvvəllər əzələ lifi tipinə xas gen proqramları ilə əlaqəli olmayan bir neçə transkripsiya faktoru daxildir. Bunlar arasında PITX1, EGR1 və MYF6 sürətli əzələ liflərində ən çox zənginləşdirilmiş transkripsiya faktorları idi (Şəkil 4E). Bunun əksinə olaraq, ZSCAN30 və EPAS1 (HIF2A kimi də tanınır) yavaş əzələ liflərində ən çox zənginləşdirilmiş transkripsiya faktorları idi (Şəkil 4E). Buna uyğun olaraq, MAFA sürətli əzələ liflərinə uyğun UMAP bölgəsində daha yüksək səviyyələrdə ifadə olunurdu, EPAS1 isə əks ifadə modelinə malik idi (Şəkil 4F).
Məlum zülal kodlayan genlərə əlavə olaraq, insan inkişafı və xəstəliklərinin tənzimlənməsində iştirak edə biləcək çoxsaylı kodlaşdırmayan RNT biotipləri mövcuddur. 51, 52 Transkriptom məlumat dəstlərində bir neçə kodlaşdırmayan RNT lif tipinə spesifiklik nümayiş etdirir (Şəkil 5A və Əlavə Məlumat Dəsti 15), o cümlədən yavaş liflər üçün yüksək spesifikliyə malik olan və mitoxondrial miopatiyası olan xəstələrdə əzələlərdə azaldığı bildirilən LINC01405. 53 Bunun əksinə olaraq, lnc-ERCC5-5 geninə (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) uyğun gələn RP11-255P5.3 54 sürətli lif tipinə spesifiklik nümayiş etdirir. Həm LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), həm də RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) skelet əzələ spesifikliyi nümayiş etdirir (Əlavə Şəkillər 9A–B) və 1 Mb genomik qonşuluqlarında məlum yığılma genlərinə malik deyillər ki, bu da onların qonşu yığılma genlərini tənzimləmək əvəzinə lif növlərinin tənzimlənməsində ixtisaslaşmış rol oynadıqlarını göstərir. Müvafiq olaraq LINC01405 və RP11-255P5.3-ün yavaş/sürətli lif tipinə spesifik ifadə profilləri RNAscope istifadə edilərək təsdiqləndi (Şəkillər 5B–C).
A. Kodlaşdırmayan RNT transkriptləri yavaş və sürətli büzülən əzələ liflərində əhəmiyyətli dərəcədə tənzimlənir. B. LINC01405 və RP11-255P5.3-ün müvafiq olaraq yavaş və sürətli büzülən lif tipinə spesifikliyini göstərən nümayəndəli RNToskop şəkilləri. Ölçü zolağı = 50 μm. C. RNToskop tərəfindən təyin olunan miofiber tipinə spesifik kodlaşdırmayan RNT ifadəsinin kəmiyyətləndirilməsi (müstəqil fərdlərdən n = 3 biopsiya, hər bir fərd daxilində sürətli və yavaş əzələ liflərini müqayisə etmək). Statistik təhlil iki quyruqlu Student t-testi istifadə edilərək aparılmışdır. Qutu qrafikləri medianı və birinci və üçüncü kvartilləri göstərir, bığlar minimum və maksimum dəyərlərə işarə edir. D. De novo mikrob zülalının identifikasiyası iş axını (BioRender.com ilə yaradılmışdır). E. LINC01405_ORF408:17441:17358 mikrob zülalı xüsusilə yavaş skelet əzələ liflərində ifadə olunur (hər iştirakçıda sürətli və yavaş əzələ lifləri müqayisə edilən müstəqil iştirakçılardan n=5 biopsiya). Statistik təhlil Limm xətti model metodu ilə birlikdə empirik Bayes yanaşması, ardınca isə p-dəyər tənzimlənməsi ilə çoxsaylı müqayisələr üçün Benjamini-Hochberq metodu istifadə edilərək aparılmışdır. Qutu qrafiklərində median, birinci və üçüncü kvartillər göstərilir, bığlar isə maksimum/minimum dəyərlərə işarə edir.
Son zamanlar aparılan tədqiqatlar göstərir ki, bir çox ehtimal olunan kodlaşdırmayan transkriptlər transkripsiya olunmuş mikrob zülallarını kodlaşdırır və bunlardan bəziləri əzələ funksiyasını tənzimləyir. 44, 55 Potensial lif tipinə spesifikliyə malik mikrob zülallarını müəyyən etmək üçün 1000 lifli proteom məlumat dəstimizdə 1000 lifli transkriptom məlumat dəstində tapılan kodlaşdırmayan transkriptlərin ardıcıllığını (n = 305) ehtiva edən xüsusi FASTA faylından istifadə edərək axtarış apardıq (Şəkil 5D). 22 fərqli transkriptdən 197 mikrob zülalı müəyyən etdik, bunlardan 71-i yavaş və sürətli skelet əzələ lifləri arasında fərqli şəkildə tənzimlənirdi (Əlavə Şəkil 9C və Əlavə Məlumat Dəsti 16). LINC01405 üçün üç mikrob zülal məhsulu müəyyən edildi, onlardan biri transkriptinə oxşar yavaş lif spesifikliyi göstərdi (Şəkil 5E və Əlavə Şəkil 9D). Beləliklə, LINC01405-i yavaş skelet əzələ lifləri üçün spesifik olan mikrob zülalını kodlayan bir gen kimi müəyyən etdik.
Fərdi əzələ liflərinin genişmiqyaslı proteomik xarakteristikası üçün hərtərəfli iş axını hazırladıq və sağlam vəziyyətlərdə lif heterojenliyinin tənzimləyicilərini müəyyən etdik. Bu iş axınını nemalin miyopatiyalarının skelet əzələ liflərinin heterojenliyinə necə təsir etdiyini anlamaq üçün tətbiq etdik. Nemalin miyopatiyaları əzələ zəifliyinə səbəb olan və təsirlənmiş uşaqlarda tənəffüs çətinliyi, skolioz və məhdud ətraf hərəkətliliyi daxil olmaqla bir sıra ağırlaşmalarla özünü göstərən irsi əzələ xəstəlikləridir. 19,20 Tipik olaraq, nemalin miyopatiyalarında aktin alfa 1 (ACTA1) kimi genlərdə patogen variantlar yavaş büzülən lif miyofiber tərkibinin üstünlük təşkil etməsinə səbəb olur, baxmayaraq ki, bu təsir heterojendir. Diqqətəlayiq istisnalardan biri sürətli liflərin üstünlük təşkil etdiyi troponin T1 nemalin miyopatiyasıdır (TNNT1). Beləliklə, nemalin miyopatiyalarında müşahidə edilən skelet əzələ liflərinin disrequlyasiyasının altında yatan heterojenliyin daha yaxşı başa düşülməsi bu xəstəliklərlə miyofiber növü arasındakı mürəkkəb əlaqəni açmağa kömək edə bilər.
Sağlam nəzarət qrupu ilə müqayisədə (qrup başına n=3), ACTA1 və TNNT1 genlərində mutasiyaları olan nemalin miyopatiyası xəstələrindən təcrid olunmuş miyofiberlər nəzərəçarpacaq dərəcədə miyofiber atrofiyası və ya distrofiyası göstərdi (Şəkil 6A, Əlavə Cədvəl 3). Mövcud materialın məhdud miqdarı səbəbindən bu, proteom analizi üçün əhəmiyyətli texniki çətinliklər yaratdı. Buna baxmayaraq, 272 skelet miyofiberində 2485 zülal aşkar edə bildik. Hər lif üçün ən azı 1000 kəmiyyətləşdirilmiş zülal üçün süzgəcdən keçirildikdən sonra 250 lif sonrakı bioinformatika analizinə məruz qaldı. Süzgüdən keçirildikdən sonra hər lif üçün orta hesabla 1573 ± 359 zülal kəmiyyətləndirildi (Əlavə Şəkil 10A, Əlavə Məlumat Dəstləri 17-18). Xüsusilə, lif ölçüsünün əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına baxmayaraq, nemalin miyopatiyası xəstə nümunələrinin proteom dərinliyi yalnız orta dərəcədə azaldı. Bundan əlavə, bu məlumatların öz FASTA fayllarımızdan (kodlaşdırmayan transkriptlər daxil olmaqla) istifadə edərək işlənməsi, nemalin miyopatiyası xəstələrindən skelet miyofiberlərində beş mikrob zülalını müəyyən etməyə imkan verdi (Əlavə Məlumat Dəsti 19). Proteomun dinamik diapazonu əhəmiyyətli dərəcədə daha geniş idi və nəzarət qrupundakı ümumi zülallar əvvəlki 1000 lifli proteom analizinin nəticələri ilə yaxşı korrelyasiya edirdi (Əlavə Şəkil 10B–C).
A. ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyalarında (NM) MYH-yə əsaslanan lif atrofiyası və ya distrofiyasını və müxtəlif lif növlərinin üstünlük təşkil etdiyini göstərən mikroskopik şəkillər. Ölçü zolağı = 100 μm. ACTA1 və TNNT1 xəstələrində boyanmanın təkrarlana bilməsini təmin etmək üçün, nümayəndə şəkilləri seçilməzdən əvvəl üç xəstə biopsiyası iki-üç dəfə (hər halda dörd bölmə) boyanmışdır. B. MYH-yə əsaslanan iştirakçılarda lif tipi nisbətləri. C. Nemalin miyopatiyaları və nəzarət qrupları olan xəstələrdə skelet əzələ liflərinin əsas komponent təhlili (PCA) qrafiki. D. Şəkil 2-də təhlil edilmiş 1000 lifdən müəyyən edilmiş PCA qrafikinə proyeksiya edilmiş nemalin miyopatiyaları və nəzarət qrupları olan xəstələrdən alınan skelet əzələ lifləri. Məsələn, ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyaları və nəzarət qrupları olan iştirakçılar və ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyaları olan iştirakçılar arasındakı fərqləri müqayisə edən vulkan qrafikləri. Rəngli dairələr π < 0.05-də əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olan zülalları, tünd nöqtələr isə FDR < 0.05-də əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olan zülalları göstərir. Statistik təhlil Limma xətti model metodu və empirik Bayes metodları ilə aparılmış, ardınca Benjamini-Hochberg metodu ilə çoxsaylı müqayisələr üçün p-dəyər tənzimlənməsi aparılmışdır. H. Bütün proteom və 1-ci və 2A tipli liflərdə əhəmiyyətli dərəcədə fərqli şəkildə ifadə olunan zülalların zənginləşdirmə təhlili. Statistik təhlil clusterProfiler paketi və Benjamini-Hochberg tənzimlənmiş p-dəyərləri ilə aparılmışdır. I, J. Hüceyrədənkənar matris və mitoxondrial gen ontologiyası (GO) terminləri ilə rənglənmiş əsas komponent təhlili (PCA) qrafikləri.
Nemalin miyopatiyaları skelet əzələlərində MYH ifadə edən miyofiber növlərinin nisbətinə təsir göstərə bildiyindən,19,20 əvvəlcə nemalin miyopatiyası olan xəstələrdə və nəzarət qrupunda MYH ifadə edən miyofiber növlərini araşdırdıq. Miyofiber növünü əvvəllər 1000 miyofiber analizi üçün təsvir edilmiş qərəzsiz metoddan istifadə edərək təyin etdik (Əlavə Şəkil 10D–E) və yenə də təmiz 2X miyofiberləri müəyyən edə bilmədik (Şəkil 6B). Nemalin miyopatiyalarının miyofiber növünə heterojen təsirini müşahidə etdik, çünki ACTA1 mutasiyaları olan iki xəstədə 1-ci tip miyofiberlərin nisbəti artmış, TNNT1 nemalin miyopatiyası olan iki xəstədə isə 1-ci tip miyofiberlərin nisbəti azalmışdır (Şəkil 6B). Həqiqətən də, MYH2 və sürətli troponin izoformlarının (TNNC2, TNNI2 və TNNT3) ifadəsi ACTA1-nemalin miyopatiyalarında azalmış, MYH7 ifadəsi isə TNNT1-nemalin miyopatiyalarında azalmışdır (Əlavə Şəkil 11A). Bu, nemalin miyopatiyalarında heterojen miyofiber tip dəyişikliyi ilə bağlı əvvəlki məlumatlarla uyğundur.19,20 Bu nəticələri immunohistokimya ilə təsdiqlədik və ACTA1-nemalin miyopatiyası olan xəstələrdə 1-ci tip miyofiberlərin üstünlük təşkil etdiyini, TNNT1-nemalin miyopatiyası olan xəstələrdə isə əks modelin olduğunu aşkar etdik (Şəkil 6A).
Tək lifli proteom səviyyəsində, ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyası xəstələrindən alınan skelet əzələ lifləri əksər nəzarət lifləri ilə qruplaşmışdı və TNNT1 nemalin miyopatiyası lifləri ümumiyyətlə ən çox təsirlənmişdi (Şəkil 6C). Bu, xüsusilə hər bir xəstə üçün yalançı şişirdilmiş liflərin əsas komponent analizi (PCA) qrafiklərini çəkərkən özünü göstərdi, TNNT1 nemalin miyopatiyası xəstələri 2 və 3 nəzarət nümunələrindən ən uzaqda görünürdü (Əlavə Şəkil 11B, Əlavə Məlumat Dəsti 20). Miyopatiya xəstələrindən alınan liflərin sağlam liflərlə necə müqayisə edildiyini daha yaxşı başa düşmək üçün sağlam yetkin iştirakçılardan 1000 lifin proteomik analizindən əldə edilən ətraflı məlumatlardan istifadə etdik. Miyopatiya məlumat dəstindən (ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyası xəstələri və nəzarət qrupu) lifləri 1000 lifli proteomik analizdən əldə edilən PCA qrafikinə proyeksiya etdik (Şəkil 6D). Nəzarət liflərində PC2 boyunca MYH lif növlərinin paylanması 1000 lifli proteomik analizdən əldə edilən lif paylanmasına bənzər idi. Lakin, nemalin miopatiyası xəstələrindəki əksər liflər, doğma MYH lif növündən asılı olmayaraq, PC2-yə doğru aşağıya doğru hərəkət edərək sağlam sürətli büzülmə lifləri ilə üst-üstə düşür. Beləliklə, ACTA1 nemalin miopatiyası olan xəstələr MYH əsaslı metodlardan istifadə edilərək kəmiyyətləşdirildikdə 1-ci tip liflərə doğru bir dəyişiklik göstərsələr də, həm ACTA1 nemalin miopatiyası, həm də TNNT1 nemalin miopatiyası skelet əzələ lifi proteomunu sürətli büzülmə liflərinə doğru dəyişdirdi.
Daha sonra hər bir xəstə qrupunu sağlam nəzarət qrupu ilə birbaşa müqayisə etdik və müvafiq olaraq ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyalarında 256 və 552 fərqli ifadə olunmuş zülal müəyyən etdik (Şəkil 6E–G və Əlavə Şəkil 11C, Əlavə Məlumat Dəsti 21). Gen zənginləşdirmə təhlili mitoxondrial zülallarda koordinasiyalı azalma aşkar etdi (Şəkil 6H–I, Əlavə Məlumat Dəsti 22). Təəccüblüdür ki, ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyalarında lif növlərinin fərqli üstünlük təşkil etməsinə baxmayaraq, bu azalma MYH əsaslı lif növündən tamamilə müstəqil idi (Şəkil 6H və Əlavə Şəkil 11D–I, Əlavə Məlumat Dəsti 23). ACTA1 və ya TNNT1 nemalin miyopatiyalarında üç mikrob zülalı da tənzimlənirdi. Bu mikroproteinlərdən ikisi, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 və ya Lnc-FOXO1 kimi də tanınır) və ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), yalnız 1-ci tip miofiblərdə fərqli bolluq göstərmişdir. ENSG00000215483_TR14_ORF67-nin əvvəllər hüceyrə dövrünün tənzimlənməsində rol oynadığı bildirilmişdir.56 Digər tərəfdən, sağlam nəzarət qrupu ilə müqayisədə ACTA1-nemalin miopatiyasında həm 1-ci, həm də 2A tip miofiblərdə ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798-ə uyğundur) artmışdır (Əlavə Şəkil 12A, Əlavə Məlumat Dəsti 24). Bunun əksinə olaraq, ribosomal zülallar nemalin miopatiyasından əsasən təsirlənməmişdir, baxmayaraq ki, RPS17 ACTA1 nemalin miopatiyasında aşağı səviyyədə tənzimlənmişdir (Şəkil 6E).
Zənginləşdirmə təhlili həmçinin ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyalarında immun sistemi proseslərinin yüksəldiyini aşkar etdi, TNNT1 nemalin miyopatiyasında isə hüceyrə adgeziyası da artdı (Şəkil 6H). Bu hüceyrədənkənar amillərin zənginləşməsi PC1 və PC2-də PCA-nı mənfi istiqamətdə (yəni ən çox təsirlənən liflərə doğru) dəyişdirən hüceyrədənkənar matris zülalları ilə əks olundu (Şəkil 6J). Hər iki xəstə qrupunda immun reaksiyalarında və sarkolemmal bərpa mexanizmlərində iştirak edən hüceyrədənkənar zülalların, məsələn, anneksinlərin (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 və onların qarşılıqlı təsir göstərən zülalı S100A1159-un (Əlavə Şəkillər 12B–C) artan ifadəsi müşahidə edildi. Bu prosesin əvvəllər əzələ distrofiyalarında gücləndiyi bildirilmişdi60, lakin bildiyimiz qədəri ilə əvvəllər nemalin miyopatiyaları ilə əlaqələndirilməmişdir. Bu molekulyar mexanizmin normal funksiyası zədədən sonra sarkolemmal bərpa və yeni əmələ gələn miyositlərin miyoliflərlə birləşməsi üçün tələb olunur58,61. Beləliklə, hər iki xəstə qrupunda bu prosesin artan aktivliyi miofiber qeyri-sabitliyinin yaratdığı zədəyə reparativ reaksiya olduğunu göstərir.
Hər bir nemalin miopatiyasının təsirləri yaxşı korrelyasiya olunmuşdu (r = 0.736) və ağlabatan üst-üstə düşmə göstərmişdir (Əlavə Şəkillər 11A–B), bu da ACTA1 və TNNT1 nemalin miopatiyasının proteom üzərində oxşar təsirlərə malik olduğunu göstərir. Lakin, bəzi zülallar yalnız ACTA1 və ya TNNT1 nemalin miopatiyasında tənzimlənmişdir (Əlavə Şəkillər 11A və C). Profibrotik zülal MFAP4, TNNT1 nemalin miopatiyasında ən çox tənzimlənən zülallardan biri idi, lakin ACTA1 nemalin miopatiyasında dəyişməz qaldı. HOX gen transkripsiyasının tənzimlənməsindən məsul olan PAF1C kompleksinin komponenti olan SKIC8, TNNT1 nemalin miopatiyasında aşağı tənzimlənmiş, lakin ACTA1 nemalin miopatiyasında təsirlənməmişdir (Əlavə Şəkil 11A). ACTA1 və TNNT1 nemalin miopatiyasının birbaşa müqayisəsi TNNT1 nemalin miopatiyasında mitoxondrial zülallarda daha çox azalma və immun sistemi zülallarında artım aşkar etmişdir (Şəkil 6G–H və Əlavə Şəkillər 11C və 11H–I). Bu məlumatlar TNNT1 nemalin miopatiyasında TNNT1 nemalin miopatiyası ilə müqayisədə müşahidə edilən daha böyük atrofiya/distrofiyə ilə uyğun gəlir (Şəkil 6A), bu da TNNT1 nemalin miopatiyasının xəstəliyin daha ağır formasını təmsil etdiyini göstərir.
Nemalin miopatiyasının müşahidə olunan təsirlərinin bütün əzələ səviyyəsində davam edib-etmədiyini qiymətləndirmək üçün TNNT1 nemalin miopatiyası xəstələrinin eyni kohortundan əzələ biopsiyalarının toplu proteomik analizini apardıq və onları nəzarət qrupu ilə (qrup başına n=3) müqayisə etdik (Əlavə Şəkil 13A, Əlavə Məlumat Dəsti 25). Gözlənildiyi kimi, nəzarət qrupu əsas komponent analizində bir-biri ilə sıx əlaqəli idi, TNNT1 nemalin miopatiyası xəstələri isə tək lif analizində müşahidə edilənə bənzər daha yüksək nümunələrarası dəyişkənlik nümayiş etdirdilər (Əlavə Şəkil 13B). Toplu analiz fərdi lifləri müqayisə etməklə vurğulanan fərqli şəkildə ifadə edilən zülalları (Əlavə Şəkil 13C, Əlavə Məlumat Dəsti 26) və bioloji prosesləri (Əlavə Şəkil 13D, Əlavə Məlumat Dəsti 27) təkrarladı, lakin fərqli lif növlərini ayırd etmək qabiliyyətini itirdi və liflər arasında heterojen xəstəlik təsirlərini nəzərə ala bilmədi.
Birlikdə götürüldükdə, bu məlumatlar tək miofiberli proteomikanın immunoblotinq kimi hədəf metodlarla aşkar edilə bilməyən klinik bioloji xüsusiyyətləri aydınlaşdıra biləcəyini göstərir. Bundan əlavə, bu məlumatlar fenotipik adaptasiyanı təsvir etmək üçün yalnız aktin lif tipləşdirməsinin (MYH) istifadəsinin məhdudiyyətlərini vurğulayır. Həqiqətən də, lif tipinin dəyişdirilməsi aktin və troponin nemalin miyopatiyaları arasında fərqlənsə də, hər iki nemalin miyopatiyası MYH lif tipləşdirməsini skelet əzələ lifinin metabolizmasından daha sürətli və daha az oksidləşdirici əzələ proteomuna doğru ayırır.
Hüceyrə heterojenliyi toxumaların müxtəlif tələblərini ödəməsi üçün vacibdir. Skelet əzələlərində bu, tez-tez müxtəlif dərəcələrdə güc istehsalı və yorğunluqla xarakterizə olunan lif növləri kimi təsvir olunur. Lakin, bunun əvvəllər düşünüləndən daha dəyişkən, mürəkkəb və çoxşaxəli olan skelet əzələ liflərinin dəyişkənliyinin yalnız kiçik bir hissəsini izah etdiyi aydındır. Texnoloji irəliləyişlər artıq skelet əzələ liflərini tənzimləyən amillərə işıq salmışdır. Həqiqətən də, məlumatlarımız 2X tipli liflərin fərqli bir skelet əzələ lifi alt növü olmaya biləcəyini göstərir. Bundan əlavə, metabolik zülalları, ribosomal zülalları və hüceyrə ilə əlaqəli zülalları skelet əzələ liflərinin heterojenliyinin əsas determinantları kimi müəyyən etdik. Proteomik iş axınımızı nematod miopatiyası olan xəstə nümunələrinə tətbiq etməklə, MYH əsaslı lif tiplərinin, xüsusən də sistem pozulduqda, skelet əzələlərinin heterojenliyini tam əks etdirmədiyini daha da nümayiş etdirdik. Həqiqətən də, MYH əsaslı lif növündən asılı olmayaraq, nematod miopatiyası daha sürətli və daha az oksidləşdirici liflərə doğru bir keçidlə nəticələnir.
Skelet əzələ lifləri 19-cu əsrdən bəri təsnif edilir. Son omics təhlilləri bizə müxtəlif MYH lif növlərinin ifadə profillərini və onların müxtəlif stimullara reaksiyalarını anlamağa başlamağa imkan verdi. Burada təsvir edildiyi kimi, omics yanaşmaları, skelet əzələ lifi növünü təyin etmək üçün tək (və ya bir neçə) markerin kəmiyyətləndirilməsinə əsaslanmadan, ənənəvi antikor əsaslı metodlara nisbətən lif tipi markerlərinin kəmiyyətləndirilməsi üçün daha yüksək həssaslıq üstünlüyünə malikdir. Biz tamamlayıcı transkriptomik və proteomik iş axınlarından istifadə etdik və nəticələri insan skelet əzələ liflərində lif heterojenliyinin transkripsiya və transkripsiya sonrası tənzimlənməsini araşdırmaq üçün birləşdirdik. Bu iş axını sağlam gənc kişilərdən ibarət kohortumuzun vastus lateralis-də zülal səviyyəsində təmiz 2X tipli liflərin müəyyən edilməməsinə səbəb oldu. Bu, sağlam vastus lateralis-də <1% təmiz 2X lifləri aşkar edən əvvəlki tək lif tədqiqatları ilə uyğun gəlir, baxmayaraq ki, bu, gələcəkdə digər əzələlərdə təsdiqlənməlidir. mRNT səviyyəsində demək olar ki, təmiz 2X liflərinin aşkarlanması ilə yalnız qarışıq 2A/2X liflərinin zülal səviyyəsində aşkarlanması arasındakı uyğunsuzluq çaşdırıcıdır. MYH izoform mRNA ifadəsi sirkadian deyil,67 bu da RNT səviyyəsində zahirən təmiz 2X liflərdə MYH2 başlanğıc siqnalını "qaçırdığımızın" ehtimalının az olduğunu göstərir. Mümkün bir izah, tamamilə hipotetik olsa da, MYH izoformları arasında zülal və/və ya mRNA sabitliyindəki fərqlər ola bilər. Həqiqətən də, heç bir sürətli lif hər hansı bir MYH izoformu üçün 100% təmiz deyil və 70-90% aralığında MYH1 mRNA ifadə səviyyələrinin zülal səviyyəsində bərabər MYH1 və MYH2 bolluğuna səbəb olub-olmayacağı məlum deyil. Lakin, bütün transkriptomu və ya proteomu nəzərdən keçirərkən, klaster analizi, dəqiq MYH tərkibindən asılı olmayaraq, yavaş və sürətli skelet əzələ liflərini təmsil edən yalnız iki fərqli klasteri inamla müəyyən edə bilər. Bu, adətən yalnız iki fərqli miyonükleer klasteri müəyyən edən tək nüvəli transkriptomik yanaşmalardan istifadə edən analizlərlə uyğundur. 68, 69, 70 Bundan əlavə, əvvəlki proteomik tədqiqatlar 2X tipli lifləri müəyyən etsə də, bu liflər digər sürətli liflərdən ayrıca toplanmır və MYH-yə əsaslanan digər lif növlərinə nisbətən yalnız az sayda fərqli bol zülal göstərir. 14 Bu nəticələr, insan skelet əzələ liflərinin MYH-yə əsaslanan üç ayrı sinfə deyil, metabolik və yığılma xüsusiyyətlərinə görə iki qrupa bölündüyü əzələ liflərinin təsnifatına dair 20-ci əsrin əvvəllərinə qayıtmalı olduğumuzu göstərir. 63
Daha da əhəmiyyətlisi, miyofiber heterojenliyi çoxölçülü olaraq nəzərdən keçirilməlidir. Əvvəlki "omics" tədqiqatları bu istiqamətə işarə edərək, skelet əzələ liflərinin ayrı-ayrı qruplar yaratmadığını, əksinə bir kontinuum boyunca düzüldüyünü göstərir. 11, 13, 14, 64, 71 Burada göstəririk ki, skelet əzələlərinin yığılma və metabolik xüsusiyyətlərindəki fərqlərə əlavə olaraq, miyofiberlər hüceyrə-hüceyrə qarşılıqlı təsirləri və tərcümə mexanizmləri ilə əlaqəli xüsusiyyətlərə görə fərqləndirilə bilər. Həqiqətən də, skelet əzələ liflərində yavaş və sürətli lif növlərindən asılı olmayaraq heterojenliyə töhfə verən ribosom heterojenliyini aşkar etdik. Yavaş və sürətli lif növündən asılı olmayaraq bu əhəmiyyətli miyofiber heterojenliyinin əsas səbəbi hələ də aydın deyil, lakin bu, müəyyən qüvvələrə və yüklərə optimal şəkildə cavab verən əzələ birləşmələri daxilində ixtisaslaşmış məkan təşkilatlanmasına, əzələ mikro mühitində digər hüceyrə növləri ilə ixtisaslaşmış hüceyrə və ya orqan-spesifik ünsiyyətə73,74,75 və ya fərdi miyofiberlər daxilində ribosom aktivliyindəki fərqlərə işarə edə bilər. Həqiqətən də, ya RPL3 və RPL3L-in paraloq əvəzlənməsi yolu ilə, ya da rRNA-nın 2′O-metilləşməsi səviyyəsində ribosomal heteroplazmiyanın skelet əzələ hipertrofiyası ilə əlaqəli olduğu göstərilmişdir76,77. Fərdi miyofiberlərin funksional xarakteristikası ilə birləşdirilmiş çoxomik və məkan tətbiqləri çoxomik səviyyədə əzələ biologiyası haqqında anlayışımızı daha da inkişaf etdirəcəkdir78.
Nemalin miyopatiyası olan xəstələrdən alınan tək miyofiberlərin proteomlarını təhlil edərək, skelet əzələlərinin klinik patofiziologiyasını aydınlaşdırmaq üçün tək miyofiber proteomikasının faydasını, effektivliyini və tətbiqini də nümayiş etdirdik. Bundan əlavə, iş axınımızı qlobal proteomik analizlə müqayisə edərək, tək miyofiber proteomikasının qlobal toxuma proteomikası ilə eyni məlumat dərinliyi verdiyini və liflərarası heterojenliyi və miyofiber tipini nəzərə alaraq bu dərinliyi genişləndirdiyini nümayiş etdirə bildik. Sağlam nəzarət qrupları ilə müqayisədə ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyalarında müşahidə edilən lif tipi nisbətində gözlənilən (dəyişkən olsa da) fərqlərə əlavə olaraq,19 MYH vasitəçiliyi ilə lif tipi dəyişməsindən asılı olmayaraq oksidləşdirici və hüceyrədənkənar remodelinqi də müşahidə etdik. Fibroz əvvəllər TNNT1 nemalin miyopatiyalarında bildirilmişdir.19 Lakin, təhlilimiz bu tapıntıya əsaslanır və ACTA1 və TNNT1 nemalin miyopatiyaları olan xəstələrin miyofiberlərində sarkolemmal bərpa mexanizmlərində iştirak edən anneksinlər kimi hüceyrədənkənar ifraz olunan stresslə əlaqəli zülalların artan səviyyələrini də aşkar edir.57,58,59 Nəticə olaraq, nemalin miyopatiyası olan xəstələrin miyofiberlərində artan anneksin səviyyəsi ağır atrofik miyofiberlərin bərpasına hüceyrə reaksiyasını təmsil edə bilər.
Bu tədqiqat bu günə qədər insanların ən böyük tək lifli tam əzələ-omika analizini təmsil etsə də, məhdudiyyətsiz deyil. Biz skelet əzələ liflərini nisbətən kiçik və homogen iştirakçı nümunəsindən və tək bir əzələdən (vastus lateralis) təcrid etdik. Buna görə də, əzələ tipləri arasında və əzələ fiziologiyasının həddindən artıq vəziyyətlərində spesifik lif populyasiyalarının mövcudluğunu istisna etmək mümkün deyil. Məsələn, yüksək təlim keçmiş sprinterlərdə və/və ya güc idmançılarında79 və ya əzələ hərəkətsizliyi dövrlərində66,80 ultra sürətli liflərin alt qrupunun (məsələn, təmiz 2X liflər) yaranma ehtimalını istisna edə bilmərik. Bundan əlavə, iştirakçıların məhdud nümunə ölçüsü, lif tipi nisbətlərinin kişilər və qadınlar arasında fərqli olduğu məlum olduğundan, lif heterojenliyindəki cins fərqlərini araşdırmağımıza mane oldu. Bundan əlavə, eyni əzələ lifləri və ya eyni iştirakçılardan nümunələr üzərində transkriptomik və proteomik analizlər apara bilmədik. Biz və başqaları ultra aşağı nümunə girişinə nail olmaq üçün omiks analizindən istifadə edərək tək hüceyrəli və tək miofibre analizlərini optimallaşdırmağa davam etdikcə (mitoxondrial miopatiyası olan xəstələrdən alınan liflərin analizində göstərildiyi kimi), tək əzələ lifləri daxilində çox omikalı (və funksional) yanaşmaları birləşdirmək imkanı daha aydın olur.
Ümumilikdə, məlumatlarımız skelet əzələlərinin heterojenliyinin transkripsiya və transkripsiyadan sonrakı amillərini müəyyən edir və izah edir. Xüsusilə, skelet əzələlərinin fiziologiyasında klassik MYH əsaslı lif növlərinin tərifi ilə əlaqəli uzun müddətdir mövcud olan bir dogmaya meydan oxuyan məlumatları təqdim edirik. Mübahisəni yeniləməyə və nəticədə skelet əzələlərinin təsnifatı və heterojenliyi anlayışımızı yenidən nəzərdən keçirməyə ümid edirik.
On dörd Qafqaz əsilli iştirakçı (12 kişi və 2 qadın) bu tədqiqatda könüllü olaraq iştirak etməyə razılıq verdi. Tədqiqat Gent Universiteti Xəstəxanasının Etika Komitəsi (BC-10237) tərəfindən təsdiq edilmiş, 2013-cü il Helsinki Bəyannaməsinə uyğunlaşdırılmış və ClinicalTrials.gov saytında (NCT05131555) qeydiyyatdan keçirilmişdir. İştirakçıların ümumi xüsusiyyətləri Əlavə Cədvəl 1-də təqdim olunur. Şifahi və yazılı məlumatlı razılıq alındıqdan sonra iştirakçılar tədqiqata son daxil edilməzdən əvvəl tibbi müayinədən keçdilər. İştirakçılar gənc (22-42 yaş), sağlam (tibbi vəziyyəti, siqaret çəkmə tarixçəsi yox idi) və orta dərəcədə fiziki aktiv idilər. Maksimum oksigen qəbulu əvvəllər təsvir edildiyi kimi fiziki hazırlığı qiymətləndirmək üçün addım erqometrindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir. 81
Əzələ biopsiyası nümunələri istirahətdə və aclıq vəziyyətində üç dəfə, 14 gün ara ilə toplanmışdır. Bu nümunələr daha böyük bir tədqiqatın bir hissəsi olaraq toplandığı üçün iştirakçılar biopsiyadan 40 dəqiqə əvvəl plasebo (laktoza), H1-reseptor antaqonisti (540 mq feksofenadin) və ya H2-reseptor antaqonisti (40 mq famotidin) qəbul etmişlər. Əvvəllər bu histamin reseptor antaqonistlərinin istirahət skelet əzələlərinin sağlamlığına təsir etmədiyini nümayiş etdirmişdik81 və keyfiyyətə nəzarət qrafiklərimizdə vəziyyətlə əlaqəli klasterləşmə müşahidə edilməmişdir (Əlavə Şəkillər 3 və 6). Hər təcrübə günündən 48 saat əvvəl standartlaşdırılmış pəhriz (41,4 kkal/kq bədən çəkisi, 5,1 q/kq bədən çəkisi karbohidrat, 1,4 q/kq bədən çəkisi protein və 1,6 q/kq bədən çəkisi yağ) saxlanılmış və təcrübə gününün səhəri standartlaşdırılmış səhər yeməyi (1,5 q/kq bədən çəkisi karbohidrat) qəbul edilmişdir. Lokal anesteziya altında (epinefrinsiz 0,5 ml 1% lidokain), perkutan Bergström aspirasiyası istifadə edilərək vastus lateralis əzələsindən əzələ biopsiyaları əldə edildi.82 Əzələ nümunələri dərhal RNT-yə yerləşdirildi və əllə lif parçalanmasına qədər (3 günə qədər) 4°C-də saxlanıldı.
Təzə təcrid olunmuş miofiber dəstələri kultura qabında təzə RNT-later mühitinə köçürüldü. Daha sonra fərdi miofiberlər stereomikroskop və incə cımbız istifadə edərək əl ilə parçalandı. Hər biopsiyadan iyirmi beş lif parçalandı və biopsiyanın müxtəlif sahələrindən liflərin seçilməsinə xüsusi diqqət yetirildi. Parçalandıqdan sonra, hər bir lif istənməyən zülalları və DNT-ni çıxarmaq üçün proteinaz K və DNase fermentləri olan 3 μl lizis buferinə (SingleShot Cell Lisis Kit, Bio-Rad) yumşaq bir şəkildə batırıldı. Hüceyrə lizisi və zülal/DNT-nin çıxarılması daha sonra qısa vorteksləmə, mayeni mikrosentrifuqada fırlatmaq və otaq temperaturunda (10 dəq) inkubasiya etməklə başladı. Daha sonra lizat termal siklerdə (T100, Bio-Rad) 37°C-də 5 dəqiqə, 75°C-də 5 dəqiqə inkubasiya edildi və sonra sonrakı emal olunana qədər dərhal -80°C-də saxlanıldı.
Illumina ilə uyğun poliadenilləşdirilmiş RNT kitabxanaları, QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Kitabxana Hazırlama Dəsti (Lexogen) istifadə edərək 2 µl miofiber lizatdan hazırlanmışdır. Ətraflı metodlar istehsalçının təlimatında tapıla bilər. Proses, tərs transkripsiya ilə birinci zəncirli kDNT sintezi ilə başlayır, bu müddət ərzində nümunələrin birləşdirilməsini təmin etmək və sonrakı emal zamanı texniki dəyişkənliyi azaltmaq üçün unikal molekulyar identifikatorlar (UMI) və nümunəyə xas i1 barkodları daxil edilir. Daha sonra 96 miofiberdən kDNT birləşdirilir və maqnit muncuqlarla təmizlənir, bundan sonra RNT çıxarılır və təsadüfi praymerlərdən istifadə edərək ikinci zəncirli sintez aparılır. Kitabxana maqnit muncuqlarla təmizlənir, hovuza xas i5/i7 etiketləri əlavə edilir və PCR gücləndirilir. Son təmizləmə mərhələsi Illumina ilə uyğun kitabxanalar yaradır. Hər bir kitabxana hovuzunun keyfiyyəti Yüksək Həssaslıqlı Kiçik Fraqment DNT Analiz Dəsti (Agilent Technologies, DNF-477-0500) istifadə edərək qiymətləndirilmişdir.
Qubit kəmiyyətləndirməsinə əsasən, hovuzlar ekvimolyar konsentrasiyalarda (2 nM) daha da birləşdirildi. Nəticədə yaranan hovuz daha sonra 2 nM yüklənmə (4% PhiX) ilə NovaSeq S2 Reagent Dəsti (1 × 100 nukleotid) istifadə edərək standart rejimdə NovaSeq 6000 cihazında ardıcıllıqla düzüldü.
Bizim boru kəmərimiz Lexogen-in QuantSeq Pool məlumat analiz boru kəmərinə (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) əsaslanır. Məlumatlar əvvəlcə i7/i5 indeksinə əsasən bcl2fastq2 (v2.20.0) ilə demultipleksləşdirildi. Daha sonra 2-ci oxunuş i1 nümunə barkoduna əsasən idemux (v0.1.6) ilə demultipleksləşdirildi və UMI ardıcıllıqları umi_tools (v1.0.1) ilə çıxarıldı. Daha sonra oxunuşlar qısa oxunuşları (<20 uzunluğunda) və ya yalnız adapter ardıcıllıqlarından ibarət oxunuşları silmək üçün bir neçə dövrədə cutadapt (v3.4) ilə kəsildi. Oxunuşlar daha sonra STAR (v2.6.0c) istifadə edərək insan genomuna uyğunlaşdırıldı və BAM faylları SAMtools (v1.11) ilə indeksləşdirildi. Dublikat oxunuşlar umi_tools (v1.0.1) istifadə edərək silindi. Nəhayət, uyğunlaşdırma sayılması Altbread-da featureCounts istifadə edilərək aparıldı (v2.0.3). Keyfiyyətə nəzarət boru kəmərinin bir neçə ara mərhələsində FastQC (v0.11.9) istifadə edilərək həyata keçirilmişdir.
Bütün sonrakı bioinformatika emalı və vizuallaşdırma işləri əsasən Seurat (v4.4.0) iş axını istifadə edilərək R (v4.2.3) dilində aparılmışdır. 83 Buna görə də, fərdi UMI dəyərləri və metaməlumatlar matrisləri Seurat obyektlərinə çevrilmişdir. Bütün liflərin 30%-dən azında ifadə edilən genlər çıxarılmışdır. Aşağı keyfiyyətli nümunələr minimum 1000 UMI dəyəri və 1000 aşkar edilmiş genin həddi əsasında çıxarılmışdır. Nəticədə, 925 lif bütün keyfiyyətə nəzarət filtrasiya mərhələlərindən keçmişdir. UMI dəyərləri Seurat SCTransform v2 metodu ilə normallaşdırılmışdır, 84-ü aşkar edilmiş bütün 7418 xüsusiyyət daxil olmaqla, iştirakçılar arasındakı fərqlər geri qaytarılmışdır. Bütün müvafiq metaməlumatlar Əlavə Məlumat Dəsti 28-də tapıla bilər.
Yayımlanma vaxtı: 10 sentyabr 2025